劉國生，王建琨，邢善濤，王海磊，陳 琳，王玉娟

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007;2.新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司，河南 新鄉(xiāng)453000)

紙色譜-分光光度法測定生物轉(zhuǎn)化體系中脫氧腺苷含量

劉國生1，王建琨1，邢善濤2，王海磊1，陳 琳1，王玉娟1

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007;2.新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司，河南 新鄉(xiāng)453000)

目的 建立紙色譜-分光光度法測定生物轉(zhuǎn)化液中脫氧腺苷(dAR)含量。方法 用不同極性的展開劑進(jìn)行紙色譜從混合物中分離dAR，分光光度法測定分離的dAR濃度。結(jié)果 測試了4種展開劑對dAR的分離效果，發(fā)現(xiàn)用展開劑正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)一次色譜可將dAR與其它成分分離。將分離并重新溶解的dAR在258 nm處測定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中的產(chǎn)物濃度。結(jié)論 該法測定結(jié)果與高效液相色譜法測定結(jié)果一致，是一種簡易有效的快速測定生物轉(zhuǎn)化體系中dAR含量的方法。

脫氧腺苷;生物轉(zhuǎn)化;紙色譜;展開劑;分光光度法

核苷類化合物是開發(fā)合成新型抗病毒、抗腫瘤藥物的一類重要原料，目前有近50%的抗病毒藥物屬于核苷類藥物，如阿昔洛韋、阿糖腺苷、利巴韋林等［1］;許多抗腫瘤藥物也屬于核苷類藥物，如阿糖胞苷、去氧氟尿苷等。這些藥物可通過化學(xué)或生物方法合成［2-3］。本實(shí)驗(yàn)室利用產(chǎn)生核苷磷酸化酶［4-5］的微生物將底物脫氧胸苷(dTR)轉(zhuǎn)化為脫氧腺苷(dAR)，以作為合成其它藥物的中間體［6-7］。轉(zhuǎn)化體系中有兩種底物和兩種產(chǎn)物，建立對產(chǎn)物進(jìn)行快速定性和定量分析方法是優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的基礎(chǔ)。測定dAR的方法可采用高效液相色譜法(HPLC)、分光光度法和紙色譜法［8-13］。HPLC樣品需要量小、結(jié)果精確，但常常會受到儀器條件制約;紙色譜簡便，適合于混合樣品的分離，但不能直接進(jìn)行定量分析;分光光度法快速、簡單，但不適合于該類混合樣品的測定。本文將紙色譜與分光光度法結(jié)合起來，建立了定量測定轉(zhuǎn)化體系中dAR的快速方法。

1 材料

dAR、dTR、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(Ade)，均為分析純生化試劑;氨水，冰醋酸，異丙醇，正丁醇，鹽酸等均為分析純。

752紫外光柵分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;BS110型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;ZF-8型三用紫外分析儀，上?？等A生化儀器制造有限公司;Eppendorf Centrifuge 5804 R冷凍離心機(jī)。

2 方法與結(jié)果

2.1 紙色譜過程及其條件選擇

2.1.1 紙色譜方法 分別配制濃度為30 mmol/L的dAR、dTR、T、Ade溶液。將新華一號濾紙裁制成20 cm×20 cm規(guī)格備用。各取對照品溶液及混合溶液2.0μL點(diǎn)樣于新華一號濾紙，用不同成份的展開劑展開，取出濾紙40℃烘干后在254 nm波長下觀察，畫出各個紫色斑點(diǎn)，測量遷移距離，計(jì)算遷移率(Rf)。

2.1.2 正丁醇-冰乙酸展開劑系統(tǒng)分離dAR 首先以不同比例的正丁醇、冰乙酸、水作為展開劑，將各對照品及混合對照品點(diǎn)樣后展開，觀察各對照品展開后的Rf值及斑點(diǎn)情況。結(jié)果表明混合對照品色譜后形成2個斑點(diǎn)，其中dAR和Ade總是在一個色譜斑點(diǎn)內(nèi)無法分開，dTR和T在另一個色譜斑點(diǎn)無法分開。說明采用該展開劑能將四種成分按嘌呤類和嘧啶類分開，但堿基與帶有相應(yīng)堿基的脫氧核苷不能有效分開。當(dāng)用正丁醇-冰乙酸-水(6∶1∶3)為展開劑時(shí)，嘌呤類與嘧啶類成分的分離效果較好，此時(shí) dAR、dTR、Ade 和 T 的 Rf值分別為 0.77，0.84，0.77 和 0.84。

2.1.3 異丙醇-氨水展開劑系統(tǒng)分離dAR 以不同比例的異丙醇、氨水、水為展開劑，紙色譜后觀察各對照品展開后的Rf值及斑點(diǎn)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ade很容易與其它三種成分分開，但其它三種成分卻不能完全分開。當(dāng)用異丙醇-氨水-水(7∶2∶1)展開時(shí)，嘌呤類與其它3種成分的分離效果最好，dAR、dTR、Ade 和 T 的 Rf值分別為0.83，0.85，0.65 和0.82。

2.1.4 雙向紙色譜分離dAR 在dAR生物合成反應(yīng)中，重點(diǎn)是將產(chǎn)物分離并進(jìn)行定量測定。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用正丁醇-冰乙酸展開劑可將dAR、Ade與dAR、T分開，而采用異丙醇-氨水展開劑可將Ade與其它成分分開，如果進(jìn)行雙向紙色譜［11］，就可能將dAR與其它各成分分開。因此實(shí)驗(yàn)首先用正丁醇-冰乙酸對混合樣品進(jìn)行分離，然后將濾紙烘干后在展開劑異丙醇-氨水中進(jìn)行第二向色譜，結(jié)果dAR與其它三種成分得到了良好的分離。經(jīng)雙向紙色譜分離的dAR樣點(diǎn)可進(jìn)一步用分光光度法進(jìn)行定量測定。

2.1.5 正丁醇-異丙醇展開劑系統(tǒng)分離dAR 雖然采用雙向紙色譜可以將dAR與其它三種成分分離，但由于要進(jìn)行二次色譜，所用時(shí)間就較長，這不利于轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程對樣品的大量分析工作。如果根據(jù)上述兩種展開劑的極性特點(diǎn)，調(diào)整展開劑成分，則有可能采用一個展開劑就可將dAR與其它三種成分分開。我們將展開劑中非極性部分調(diào)整為正丁醇與異丙醇，極性成分使用冰乙酸或氨水，考察其對四種成分的分離情況。

以正丁醇-異丙醇-冰乙酸為展開劑，經(jīng)過不同的配比色譜試驗(yàn)，結(jié)果顯示該展開劑對四種成分的分離效果均不理想(圖1A)，目標(biāo)產(chǎn)物與其它成分不能有效分離，其中正丁醇-異丙醇-冰乙酸-水(3∶3∶2∶2)為展開劑時(shí)，dAR、dTR、Ade 和 T 的 Rf值分別為0.83，0.87，0.83 和 0.87。以正丁醇-異丙醇-氨水為展開劑對混合樣品進(jìn)行紙色譜，四種樣品混合樣經(jīng)過色譜出現(xiàn)三個色譜斑點(diǎn)(圖1B)，其中dAR單獨(dú)為一個斑點(diǎn)，Rf值最大，位置在最前方;dTR和T在一個斑色譜點(diǎn)中，二者不能完全分開;Ade單獨(dú)成一個斑點(diǎn)，Rf值最小，位置在最后面。雖然在此系統(tǒng)中dAR與T仍不能有效分開，但是作為目的產(chǎn)物的dTR或作為底物之一的Ade都得到了良好的分離效果，因此可對轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)成功進(jìn)行定性鑒定，也可為為產(chǎn)物濃度或底物濃度變化進(jìn)行定量分析奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)表明，正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)為展開劑時(shí)的分離效果最好，此時(shí)dAR、dTR、Ade和 T 的 Rf值分別為 0.80，0.72，0.62 和 0.72，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用此比例的展開劑對轉(zhuǎn)化體系中的dAR進(jìn)行紙色譜分離。

圖1 正丁醇-異丙醇-冰醋酸、正丁醇-異丙醇-氨水紙色譜對4種化合物的分離結(jié)果Fig.1 The separated result of four compounds obtained by the paper chromatography method with chromatographic solution nbutanol-isopropyl alcohol-glacial acetic acid and n-butanol-isopropyl alcohol-ammonia

2.2 紙色譜-分光光度法方法學(xué)試驗(yàn)

2.2.1 dAR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將10～60 mmol/L dAR對照品溶液各2.0μL點(diǎn)樣于新華一號濾紙，用正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)展開。待展開劑上行至距濾紙頂端2.0 cm左右時(shí)，取出，40℃烘干后，在254 nm波長下觀察，畫出紫色斑點(diǎn)，剪下斑點(diǎn)于5 mL離心管中，加水3 mL浸泡一定時(shí)間，在258 nm波長處測定吸光度(A)值，繪制dAR標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性擬合，得到的線性回歸方程為:C=101.01 A －3.72，r=0.999 7。

2.2.2 紙色譜-分光光度測定dAR含量的重復(fù)性試驗(yàn) 將含有30 mmol/L dAR的四種對照品混合液定量點(diǎn)樣后，以展開劑正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)進(jìn)行紙色譜，將色譜的dAR樣品點(diǎn)剪下，水浸泡后測定258 nm波長處的A值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算dAR濃度。5次重復(fù)測定結(jié)果的RSD為0.34%。

2.3 紙色譜-分光光度測定轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中dAR含量

2.3.1 菌種培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化反應(yīng) 本試驗(yàn)篩選的轉(zhuǎn)化合成dAR菌株，試管斜面保存。斜面培養(yǎng)基為酵母膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，水 1 000 mL，瓊脂2.0%，pH 7.0 ～7.5。產(chǎn)酶培養(yǎng)基為牛肉膏10 g，酵母膏15 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 7.0。

在500 mL錐形瓶加入產(chǎn)酶培養(yǎng)基120 mL，滅菌，從斜面上挑取菌體一環(huán)，37℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)20 h，4℃，5 000 r/min離心10 min，得菌體，－20℃下冷凍備用。

在磷酸鹽緩沖液中添加dTR、Ade和轉(zhuǎn)化用的菌體細(xì)胞，攪拌反應(yīng)5 h后取樣分析。

2.3.2 轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中dAR分光光度測定 在測定轉(zhuǎn)化體系中dAR時(shí)，需將轉(zhuǎn)化體系取1 mL，4℃，10 000 r/min 離心1 min，取上清液，點(diǎn)樣2.0 μL，并點(diǎn)樣四種對照品混合溶液，展開后，烘干、畫出與dAR對照品斑點(diǎn)位置一致的紫色斑點(diǎn)，剪下，用水3 mL浸泡120 min，測定A值，根據(jù)dAR標(biāo)準(zhǔn)曲線算出其含量。表1為一次溫度條件轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的測定結(jié)果，轉(zhuǎn)化率以Ade為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算。

表1 紙色譜-分光光度法測定轉(zhuǎn)化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The deoxyadenosine content in biotransformation system measured by paper chromatography-spectrophotometry method

2.3.3 轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中dAR回收率測定 取dAR轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化液，4℃，10 000 r/min離心1 min，取上清液，用HPLC法精確測定dAR含量［14］，然后精確稀釋至20 mmol/L的濃度。用紙色譜-分光光度法測定dAR含量。紙色譜點(diǎn)樣時(shí)分別點(diǎn)5個樣點(diǎn)，點(diǎn)樣量為2.0μL，待樣點(diǎn)干后再分別覆蓋點(diǎn)樣0，10，20，30，40 mmol/L dAR 對照品各 2.0 μL，然后用正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)進(jìn)行色譜分離、分光光度測定，計(jì)算dAR濃度及其回收率(表2)。平均回收率為99.4%，RSD為0.99%。表明采用展開劑正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)分離轉(zhuǎn)化液各成分，dAR得到良好分離，與對照品混合物色譜分離效果相同;分光光測定轉(zhuǎn)化液中dAR的濃度與HPLC法一致，試驗(yàn)重復(fù)性良好，回收率可達(dá)99%以上。

表2 轉(zhuǎn)化液中dAR含量測定及回收率試驗(yàn)Tab.2 The measuring results of deoxyadenosine content and recovery in biotransformation system

3 討論

用正丁醇-冰乙酸-水(6∶1∶3)、異丙醇-氨水-水(7∶2∶1)分別作為單向紙色譜的展開劑，均不能實(shí)現(xiàn)將目標(biāo)物dAR與其它成分分開，但先后用兩種展開劑進(jìn)行雙向紙色譜可將dAR與其它堿基和核苷成分有效分離開，以此為基礎(chǔ)結(jié)合紫外分光光度法即可實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)化過程dAR產(chǎn)物的定量。該測定方法雖然簡單，但一個樣品要進(jìn)行2次紙色譜，所用時(shí)間增加了一倍，這顯然對于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的分析測定不利。為了簡化雙向色譜為一次色譜，調(diào)整上述兩種展開劑的極性與非極性成分及比例，結(jié)果其中以正丁醇-異丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)為展開劑，可以一次色譜將dAR、Ade分別與其它成分分離，進(jìn)一步用分光光度法測定分離的dAR量，即可計(jì)算出轉(zhuǎn)化體系中的dAR濃度。該測定結(jié)果可靠，與HPLC法一致，且重復(fù)性好，回收率高，更重要的是時(shí)間測定縮短了一半。在沒有高效液相色譜儀的條件下，該方法是一種操作簡易、準(zhǔn)確性好、成本較低的快速定性和定量的分析方法。此外，與HPLC相比，該方法的優(yōu)點(diǎn)是可在一張濾紙上分離10～20個樣品，可同時(shí)進(jìn)行多個紙色譜分離，由于分光光度測定用時(shí)很少，因此紙色譜-分光光度法每測定一個樣品的時(shí)間實(shí)際比HPLC法短。紙色譜-分光光度測定dAR方法的建立，可以滿足dAR轉(zhuǎn)化條件實(shí)驗(yàn)、菌種篩選、產(chǎn)品檢測等大量定量測定工作的需要，對dAR的研究與開發(fā)具有重要意義。

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Determination of deoxyadenosine in biotransformation system by paper chromatography-spectrophotometry

LIU Guo-sheng1，WANG Jian-kun1，XING Shan-tao2，WANG Hai-lei1，CHEN Lin1，WANG Yu-juan1
(1.School of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007，China;2.Xinxiang Tuoxin Biochemical Technology ＆ Science Co.，Ltd.，Xinxiang 453000，China)

Purpose To establish a paper chromatography-spectrophotometry method for the determination of deoxyadenosine content quickly and easily in biotransrormation system.Methods The deoxyadenosine product was separated from mixture by means of the paper chromatography method with different polarity chromatographic solutions，and the concentration of separated deoxyadenosine was measured with spectrophotometer.Results The separation effect of 4 kinds chromatographic solutions were tested.The separation of deoxyadenosine could be achieved effectively，when solution n-butanol-isopropyl alcohol-ammonia solution-water(3∶3∶2∶2)was used as solvent to do single-dimensional paper chromatography.The separated deoxyadenosine was re-dissolved，and its absorption value was measured at 258 nm.The concentration of deoxyadenosine in biotransformation liquid could be calculated according to th e absorption valueand standard curve.Conclusion The determining results by of paper chromatography-spectrophotometry method was the same as that by HPLC method.This method was simple and effective with a good reproducibility for the determination of deoxyadenosine product in biotransrormation system.

deoxyadenosine;biotransformation;paper chromatography;chromatographic solution;spectrophotometry

TQ460.7;R927.2

A

1005-1678(2012)02-0132-04

2010-12-06

國家科技部科技人員服務(wù)企業(yè)行動項(xiàng)目(2009GJD00044);河南省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2008A180018)

劉國生，男，博士，教授，從事工業(yè)微生物研究，E-mail:hnliugs@163.com。