郝蕾蕾，張典瑞

(山東大學 藥學院 藥劑教研室，山東 濟南 250012)

單抗免疫納米粒的研究進展

郝蕾蕾，張典瑞

(山東大學 藥學院 藥劑教研室，山東 濟南 250012)

單抗免疫納米粒的制備及分析評價方法的研究對于提高藥物的主動靶向性、增強藥物療效、開發(fā)新劑型具有重要意義。本文對目前單抗與納米粒的偶聯(lián)技術、定性評價、存在的問題及改進方法等進行了總結和比較，為單抗免疫納米粒這種新型藥物載體的設計和應用提供參考。

單抗;免疫納米粒;偶聯(lián)技術

納米粒(Nanoparticles)一般是指由天然或合成的高分子材料制成的粒度為納米級(1～1 000 nm)的固態(tài)膠體微粒。單抗免疫納米粒是指在偶聯(lián)劑的作用下，將天然或修飾的單抗分子偶聯(lián)到含有適當功能基因的納米粒上。單抗免疫納米粒具有靶向性強、毒副作用小、半衰期長、運載量大等優(yōu)點。本文總結了單抗藥物的研究現(xiàn)狀，重點論述了單抗免疫納米粒中單抗與納米粒的偶聯(lián)技術，同時進行比較分析并討論了其定性評價及應用問題。

1 單抗藥物的研究現(xiàn)狀

單克隆抗體既可以單獨作為藥物也可以與藥物形成免疫偶聯(lián)物用于疾病的診斷和治療，研究成果顯著但應用上存在很多問題。目前被廣泛研究的單抗免疫納米粒能很好解決其不足之處并具有明顯優(yōu)勢。單抗不同應用方式的優(yōu)缺點如表1所示。

2 單抗免疫納米粒的偶聯(lián)技術

表1 單抗應用概況及優(yōu)缺點比較

單抗與納米粒偶聯(lián)，既能發(fā)揮單抗的辨識和特異靶向能力，又能發(fā)揮納米粒增強藥物吸收和細胞內穩(wěn)定性的能力，從而達到兩者特性的聯(lián)合［10］。單抗與納米粒偶聯(lián)有多種方式，其中非共價吸附和共價偶聯(lián)的方式已被報道和應用，共價偶聯(lián)包括非定向偶聯(lián)和定向偶聯(lián)。所選的偶聯(lián)方式應具有特異性，不會引起廣泛的交聯(lián)，并能保證免疫納米粒的穩(wěn)定。

2.1 非共價吸附

非共價吸附必須要有適合的條件，吸附有兩種方式:靜電和疏水性相互作用?？赏ㄟ^控制基質的離子強度達到適合的pH值及帶電情況來調節(jié)吸附行為。紫杉醇PLGA納米粒帶有負電荷，與用陽離子的多肽聚賴氨酸標記的抗體SM5-1通過靜電相互作用制備免疫納米粒，與未偶聯(lián)單抗的紫杉醇PLGA納米粒相比，其體外抗肝癌細胞系的毒性顯著增強［11］。吸附是可逆非特異性反應，因而具有一些劣勢:單抗必須要有較高的濃度;單抗在納米粒表面是無方向、散亂排布的;由于非共價吸附不穩(wěn)定，單抗能被其它生物分子所取代。對此，可以將納米粒表面進行化學策略性修飾使單抗和納米粒發(fā)生區(qū)域特異性相互作用來減少散亂性。

2.2 單抗與納米粒非定向偶聯(lián)

EDC(EDAC，乙基-二甲氨基-丙基碳化二亞胺)被用來形成各種化學偶聯(lián)物，它能夠和一個羧酸基團反應形成一個高活性的中間體O-acylisourea，這個活性中間體會繼續(xù)和親核基團如伯胺基發(fā)生反應形成酰胺鍵。EDC的優(yōu)勢就在于其水溶性，無需用有機溶劑溶解就可以直接加入到反應混合物中，很適用于連接生物活性分子。黃開紅等［12］采用抗VEGF單抗與5-氟尿嘧啶(5-FU)聚乳酸納米粒在EDC作用下通過化學鍵偶聯(lián)方法制備了具有靶向功能的5-FU免疫納米粒，其能顯著提高腫瘤局部藥物濃度，具有免疫導向和緩釋藥物雙重活性功能。Xu等［13］用EDC作為交聯(lián)劑合成了抗Her-2聚合物免疫熒光納米粒，其能有效辨識卵巢癌細胞并具有靈敏度高、耐光性強等特點，為卵巢癌診斷提供了新的方式。

單抗可以借助共價反應不可逆地偶聯(lián)到納米粒上，形成的共價鍵穩(wěn)定且重現(xiàn)性好，但必須確保單抗的生物活性不被影響。共價偶聯(lián)相比于非共價吸附的優(yōu)點是共價鍵阻止了單抗被血液中的成分競爭性取代，但具體哪個更好不能一概而論。例如:熒光染料標記的單抗PLGA免疫納米粒能夠識別乳腺癌細胞內高表達的細胞角蛋白，用于靶向侵入性上皮乳腺癌細胞。非共價吸附和共價偶聯(lián)都被使用進行比較，通過細胞裂解物結合實驗測定，只有非共價吸附的結合方式保留了識別能力，這可能是因為當肽類不帶電的時候會導致溶解性差，從而發(fā)揮了更大的疏水特性可以和納米粒的疏水性表面相互作用［14］。

在用EDC試劑進行的共價反應中，反應基團是氨基和羧基，但是這兩個基團也存在單抗分子中，這可能導致單抗的自聚合作用而不是連接到納米粒上。這些聚合了的單抗失去了特異性識別能力，不能用于藥物靶向［15］。在抗原抗體結合區(qū)域內部的氨基基團也能被共價偶聯(lián)影響，損害了其生物活性［16］。單抗直接共價偶聯(lián)到納米粒表面可能阻止了單抗的可接近性，也改變了納米粒的表面特性，因此這不是一個最優(yōu)的偶聯(lián)反應。

2.3 單抗和納米粒定向偶聯(lián)

單抗和納米粒定向偶聯(lián)是指單抗通過Fc片段與納米粒偶聯(lián)，使其Fab片段的抗原結合位點在納米粒表面定向朝外而有利于靶向。定向偶聯(lián)很大的優(yōu)勢就在于每個納米粒都具有較高的單抗負載量，單抗活性不會改變而且在高離子濃度的基質中保持穩(wěn)定。單抗與納米粒偶聯(lián)的方法很多，連接分子如蛋白質A(從金黃色葡萄球菌細胞壁中分離得到的一種蛋白質)在很大程度上能減少立體阻礙而被廣泛使用。當?shù)鞍踪|A被吸附在納米粒的表面后，它能特異性地和單抗的Fc片段相互作用使單抗很容易被偶聯(lián)到納米粒上，并通過Fab片段與特異性抗原結合。還可以使用一些醛類，環(huán)氧化物，硫醇等進行納米粒表面的功能化，再用這些功能基團與單抗定向偶聯(lián)。

Wagner等［17］用聚乙二醇-α-馬來酰亞胺-ω-琥珀酰亞胺酯作為交聯(lián)劑，交聯(lián)劑一端和載有多柔比星的HSA納米粒作用，另一端和被引入單抗DI17E6中的巰基反應從而使單抗和納米粒共價偶聯(lián)。該免疫納米粒細胞毒性增強并可將多柔比星輸送到αvβ3高表達的腫瘤細胞，是很有潛力的靶向傳遞系統(tǒng)。Marites等［18］首先將抗EGFR抗體用DTPA(二乙烯三胺五乙酸)及ATA(?；牧虼宜猁})進行修飾，然后在羥胺作用下暴露出游離巰基，最后與中空金納米粒通過S-Au鍵結合得到穩(wěn)定性良好的免疫金納米粒，用于靶向EGFR高表達的癌細胞并經由輻射熱效應將其殺滅。Liao等［19］用β-巰基乙胺將西妥昔單抗硫醇化，然后將其偶聯(lián)到載有多柔比星和超磁性氧化鐵(SPIO)的聚乙二醇-聚己內酯納米粒上，該免疫納米粒既可用作核磁共振成像的造影劑，又能有效傳遞多柔比星和SPIO到EGFR高表達的腫瘤細胞內并產生很大的殺傷效應，實現(xiàn)了診斷與治療雙重功能的聯(lián)合。

定向共價偶聯(lián)在增加單抗穩(wěn)定性的同時能控制可利用的單抗偶聯(lián)位點，是最佳的生物偶聯(lián)方式。對于單抗的硫醇化需要注意的是:硫醇化時間越長，硫醇化試劑過量比例越大，發(fā)生單抗二聚化的可能性越大，這可能是在兩個單抗分子間形成了二硫鍵所致。所以單抗硫醇化時間和硫醇化試劑加入量要合理設定才能保證單抗的硫醇化效果，從而保持單抗的活性。

2.4 多級共價偶聯(lián)

多級共價偶聯(lián)是以抗生物素蛋白-生物素相互作用為基礎將單抗偶聯(lián)到納米粒表面的方法。Balthasar等［20］制備了免疫明膠納米粒。首先，將功能化的巰基基團被引入到明膠納米粒表面;然后，共價偶聯(lián)NeutrAvidinTM(NAv)到硫醇化的納米粒上得到NAv修飾的納米粒;最后，NAv修飾的明膠納米粒與生物素化的抗CD3抗體通過形成抗生物素蛋白-生物素復合物而共價偶聯(lián)。該免疫納米?？梢詫⑺幬锾禺惏邢虻絋淋巴細胞，在淋巴細胞受體介導的細胞攝取方面顯示出應用前景。

2.5 多重單抗與納米粒偶聯(lián)

多重單抗與納米粒偶聯(lián)能達到多種功能的聯(lián)合而且每個單抗都以利于生物標記的方式定向排列在納米粒表面，可用來合成多功能造影劑。例如:選擇酰肼-聚乙二醇-二巰基化物作為連接子，連接抗肌動蛋白和抗生物素抗體到同一個金納米粒上，肌動蛋白作為靶向抗體，生物素化了的TATHA2肽被連接到抗生物素抗體上以實現(xiàn)造影劑在細胞質的傳遞，利用PEG-SH來覆蓋剩余裸露的金納米粒表面以減少非特異性相互作用，同時聚乙二醇的親水性也改善了免疫納米粒的生物相容性［21-22］。Fujita等［23］將兩個不同的單抗共價偶聯(lián)到同一個聚蘋果酸納米粒上，一個是能引導偶聯(lián)物通過血腦屏障的單克隆抗轉鐵蛋白受體抗體，另一個是能靶向腫瘤細胞表面核小體的單克隆抗體2C5，兩種抗體的存在及生物活性都被ELISA證實，體內實驗顯示其在人神經膠質瘤中能夠大量蓄積。多重單抗與納米粒偶聯(lián)需要注意多重單抗的比例選擇，比例不同會很大程度地影響單抗在納米粒表面的平均分布，從而影響其傳遞性與靶向性。

3 單抗免疫納米粒的定性評價

3.1 免疫納米粒偶聯(lián)情況的測定

單抗是否偶聯(lián)到納米粒上，是通過共價偶聯(lián)還是非共價吸附，偶聯(lián)到納米粒上的數(shù)量多少，這對于免疫納米粒的成功構建及發(fā)揮特異性靶向作用非常關鍵。可通過流動細胞計數(shù)，表面等離激元，蛋白質含量測定、掃描電子顯微鏡及熒光顯微鏡檢查等方法進行測定，這些方法可以單獨或聯(lián)合使用。

3.2 識別特性及特異靶向性評價

偶聯(lián)后納米粒上單抗活性的保持對于實現(xiàn)納米粒的靶向功能至關重要，可以用ELISA法檢測免疫納米粒中單抗的活性，利用間接免疫熒光法觀察免疫納米粒與細胞的特異性反應，考察其對細胞的識別力和親和力。對于免疫納米粒的特異靶向性，可以通過熒光標記及電鏡檢視來觀察其在共培養(yǎng)細胞中對特定細胞的特異性靶向來確定和評價，同時與未偶聯(lián)納米粒的散亂靶向作對比。

3.3 粒徑和聚分散性評價

納米粒的粒徑影響藥物的釋放、組織分布及從器官中的清除，是一個非常重要的參數(shù)。納米載體系統(tǒng)在80～200 nm時因為EPR效應能顯著蓄積在腫瘤組織中并能阻止被網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)快速的清除，窄的粒徑分布確保了納米粒的均一性和穩(wěn)定性。納米粒的粒徑大小能影響單抗的結構和活性，粒徑較大的納米粒與單抗接觸的有效表面積較大，使單抗變性的可能性就增大;粒徑較小的納米粒與單抗接觸的表面積較小，與單抗相互作用的配基較少，使單抗變性的可能性就小。從活性方面考慮，較大納米粒立體上阻止單抗到達結合位點或是活性部位的能力要強于較小納米粒，同時較大納米粒更難保持溶解狀態(tài)，所以單抗與納米粒偶聯(lián)后要控制納米粒粒徑增加的尺度，以免導致溶解度減?。?4］。Cirstoiu-Hapca等［25］通過SEM測得抗HER2紫杉醇免疫納米粒的平均粒徑是(148±28)nm，未偶聯(lián)單抗的納米粒平均粒徑是(132±21)nm，粒徑沒有顯著改變且確保了均一性分布。

3.4 Zeta電位測定

納米粒表面電荷由于靜電力的存在影響懸浮液的穩(wěn)定性，也能影響和細胞的相互作用，因此免疫納米粒的構建不能顯著影響表面電荷。Cirstoiu-Hapca等［25］測定了抗HER2紫杉醇免疫納米粒的Zeta電位是(0.2±0.1)mV，未偶聯(lián)單抗時Zeta電位是(－1.3±0.4)mV，可見單抗的偶聯(lián)并沒有顯著改變納米粒的表面電荷，確保了免疫納米粒的穩(wěn)定。

4 結語

如何提高單抗免疫納米粒的活性、穩(wěn)定性、組織靶向性，如何增加靶部位有效藥物濃度等是目前亟待解決的問題。這些問題可以通過提高單抗的純度和特異性，合理設計單抗與納米粒的偶聯(lián)方式、純化步驟等來改進。此外還需采用可靠靈敏的分析技術來檢驗和評價。雖然臨床上還沒有單抗免疫納米粒的藥品問世，相信隨著生物技術、新載體材料以及藥物新劑型的發(fā)展，在不久的將來一定會開發(fā)出高效、安全、使用方便的單抗免疫納米粒新劑型，從而在診斷和治療學方面開辟一條新的道路。

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The research progress of monoclonal antibody immuno-nanoparticles

HAO Lei-lei，ZHANG Dian-rui
(School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China)

R944.9

A

1005-1678(2012)02-0195-04

2011-02-20

郝蕾蕾，女，碩士研究生，Tel:0531-88380293;張典瑞，通信作者，教授，博士生導師，Tel:0531-88382015，E-mail:zhangdianrui2006@163.com。