傅亞婷 艾秀清 成 芳 (新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830016)

目前乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制尚不完全清楚，研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌發(fā)病的病理生理過(guò)程是基因累積效應(yīng)和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果〔1〕。在相同的環(huán)境條件下個(gè)體的基因背景決定了乳腺癌的易感性〔2〕。目前已發(fā)現(xiàn)多種與乳腺癌發(fā)病相關(guān)的易感基因，其中作為 DNA修復(fù)基因的乳腺癌易感基因1(BRCA1)是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)BRCA1在癌組織中的表達(dá)具有種族差異性〔3〕。故本研究選取新疆地區(qū)維吾爾族和漢族乳腺癌患者，觀察BRCA1在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)及其民族差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 從新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院組織標(biāo)本庫(kù)選取2010年11月至2011年6月收治的經(jīng)過(guò)臨床病理確診、術(shù)前均未經(jīng)放療和化療、臨床資料完整的女性乳腺癌患者140例，其中維吾爾族、漢族各70例乳腺癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，用于mRNA檢測(cè)。隨機(jī)選取維吾爾族27例、漢族27例用于檢測(cè)蛋白表達(dá);年齡 26～72歲，平均年齡：維吾爾族(45.81±18.64)歲，漢族(49.37±21.93)歲。乳腺癌組織分級(jí)按2003年WHO標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌118例、髓樣癌8例、小葉癌10例、大葉腺癌4例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移89例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例。雌激素受體(ER)陽(yáng)性88例、ER陰性52例。孕激素受體(PR)陽(yáng)性97例、PR陰性43例。

1.1.2 一般情況 入組樣本必須滿足維、漢之間在年齡分層、病理分級(jí)、腫塊大小、免疫組化情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的分布無(wú)顯著差異，保證入組樣本在維、漢之間的均衡可比性，見表1。

1.1.3 主要試劑與儀器 RNA提取試劑Trizol(美國(guó)Invitrogen公司);RevertAid逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Fermentas公司)，PCR即用試劑盒、SYBR實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒、引物合成(大連寶生物工程有限公司)，一抗兔抗-BRCA1/BAP1(北京Bioss公司)，抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)鼠單克隆抗體、羊抗兔二抗、蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、非預(yù)染Marker、麗春紅染色試劑(北京康為試劑生物科技有限公司)。icycler型PCR擴(kuò)增儀、DC2000凝膠成像分析儀、iQ5熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

表1 入組標(biāo)本一般情況均衡性比較(n=70，n)

1.2 方法

1.2.1 采用SYBR熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BRCA1 mRNA在組織中的表達(dá) 操作步驟：用Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度和純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體按操作手冊(cè)執(zhí)行。擴(kuò)增后，用2%瓊脂糖凝膠，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。實(shí)時(shí)定量PCR按照SYBRR PremixExTaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa)操作手冊(cè)執(zhí)行。見表2。用β-actin進(jìn)行內(nèi)參校正，檢測(cè)出的結(jié)果是目的基因BRCA1與參照基因β-actin的比值。

表2 各基因的引物序列、PCR產(chǎn)物片段大小和RT-PCR擴(kuò)增條件

1.2.2 采用Western印跡技術(shù)檢測(cè)BRCA1在組織中的蛋白表達(dá) 蛋白提取液按1∶99加蛋白酶抑制劑混勻，按1∶10(g/ml)加樣品中勻漿后提取總蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)試劑盒進(jìn)行蛋白定量。配制8%的分離膠，5%的濃縮膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用半干法按照電流1.2 mA/cm2膜面積，恒流轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后麗春紅染色試劑染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。5%脫脂奶粉〔Tris鹽酸緩沖液(TBST)溶解的，pH7.5〕室溫封閉1 h。封閉液稀釋一抗，室溫孵育30 min，4℃過(guò)夜。TBST洗膜后用Western印跡 封閉液Ⅱ稀釋二抗，室溫40 min。TBST洗膜后用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。使用DNR熒光凝膠成像系統(tǒng)Micro Chemi曝光成像。顯影結(jié)果使用ImageJ軟件進(jìn)行分析處理，結(jié)果用相對(duì)光密度值(ROD)×面積(mm2)表示。BRCA1蛋白的相對(duì)含量用(目的條帶的ROD×mm2)/(β-actin條帶的ROD×mm2)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以x±s表示，癌與癌旁的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩民族間比較采用成組t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)乳腺癌組織及癌旁組織中BRCA1 mRNA的表達(dá) 維吾爾族、漢族乳腺癌組織中BRCA1 mRNA表達(dá)均低于相應(yīng)癌旁組織(P＜0.05)，見圖1、表3。維吾爾族乳腺癌組織較癌旁組織BRCA1 mRNA表達(dá)降低的幅度(－0.756±0.239)高于漢族(－0.255±0.075)(P＜0.05)。

圖1BRCA1 mRNA基因擴(kuò)增電泳圖

2.2 Western印跡法檢測(cè)乳腺癌組織及癌旁組織中BRCA1蛋白表達(dá) 維吾爾族、漢族乳腺癌組織中BRCA1蛋白表達(dá)均低于相應(yīng)癌旁組織(P＜0.05)。見圖2，表4。維吾爾族乳腺癌組織較癌旁組織BRCA1蛋白表達(dá)降低的幅度(－4.282±0.278)明顯高于漢族(－1.901±0.278)(P＜0.05)。

表3 BRCA1 mRNA在乳腺癌患者癌組織及癌旁組織的表達(dá)(x±s)

表4 BRCA1蛋白在乳腺癌患者癌組織及癌旁組織的表達(dá)(x±s)

圖2 BRCA1蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織的表達(dá)

3討論

BRCA1是與乳腺癌發(fā)生相關(guān)的DNA修復(fù)基因，在損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用〔4〕。乳腺組織中BRCA1表達(dá)缺失可促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生。研究表明，BRCA1 mRNA在乳腺癌組織中表達(dá)下降，并且與預(yù)后相關(guān)〔5〕。Marcus等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，美國(guó)女性散發(fā)性乳腺癌中，癌細(xì)胞與正常上皮細(xì)胞相比較，癌細(xì)胞中BRCA1表達(dá)減少，且BRCA1的減少與潛在高惡性有顯著聯(lián)系。BRCA1基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)有一致性，腫瘤發(fā)生時(shí)出現(xiàn)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平的蛋白表達(dá)下降。故認(rèn)為癌組織中BRCA1的表達(dá)降低與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。

李鴻濤等〔7〕檢測(cè)維吾爾族女性乳腺癌組織中BRCA1失表達(dá)率為37.9%，根據(jù)研究顯示維吾爾組BRCA1表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于漢族女性組，提示維、漢女性散發(fā)性乳腺癌組織BRCA1的陽(yáng)性表達(dá)可能存在種族差異;維吾爾族散發(fā)性乳腺癌組BRCA1表達(dá)低于維吾爾族乳腺纖維瘤組，提示BRCA1蛋白的失表達(dá)或低表達(dá)和新疆維吾爾族散發(fā)性乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)維吾爾族乳腺癌組織與癌旁組織BRCA1基因表達(dá)降低的幅度明顯高于漢族，維、漢之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。認(rèn)為種族遺傳背景可能成為影響B(tài)RCA1基因表達(dá)的因素，維吾爾族可能更容易發(fā)生乳腺癌易感基因表達(dá)的降低或缺失，本文推測(cè)BRCA1基因可能在維吾爾族的遺傳背景下有其獨(dú)特的腫瘤學(xué)行為，BRCA1基因表達(dá)缺失或表達(dá)降低有可能與維吾爾族乳腺癌的發(fā)生關(guān)系更為密切。

作為重要的DNA修復(fù)基因，BRCA1等基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平表達(dá)的改變?cè)诓煌潭壬嫌绊懥巳橄侔┑陌l(fā)生，并表現(xiàn)出種族差異。后續(xù)的研究中課題組將加大樣本量，對(duì)BRCA1基因與維、漢乳腺癌的關(guān)系做進(jìn)一步的分析。

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