孫 贇 蔡文瑋 胡 萍 (上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院老年病科，上海 200011)

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)術(shù)廣泛開(kāi)展的重要因素之一〔1〕，尤其是許多亞組患者，如糖尿病或小血管彌漫性病變，發(fā)生率更高。血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)過(guò)度增生所致的新生內(nèi)膜增厚，是造成PTCA術(shù)后血管再狹窄的主要原因〔2〕。Forkhead家族具有一個(gè)高度保守的DNA結(jié)構(gòu)域，自1989年首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，這一新興的轉(zhuǎn)錄因子家族已經(jīng)有了19個(gè)亞家族，表現(xiàn)出生物活性的高度多樣性，其家族成員FKHRL-1(FoxO3a)，更是廣泛表達(dá)于多個(gè)組織器官中，在細(xì)胞發(fā)育、代謝、凋亡及癌變過(guò)程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用。本研究探討FKHRL-1基因轉(zhuǎn)染對(duì)VSMC增殖能力的影響，為基因治療PTCA術(shù)后再狹窄在實(shí)際中的應(yīng)用提供一種可行的途徑。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 清潔級(jí)SD大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，雄性，體質(zhì)量280～320 g;動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2007-2005，使用許可證號(hào)為SYXK(滬)2007-2007。其中，先取21只SD大鼠分成對(duì)照組(C1組，n=3)和球囊損傷組(S組，n=18)，其中球囊損傷組又分為：損傷后0.5 h(S1組，n=3)、1 h(S2 組，n=3)、2 h(S3 組，n=3)、3 h(S4 組，n=3)、6 h(S5組，n=3)和12 h(S6組，n=3)。再取15只SD大鼠，完成頸總動(dòng)脈球囊損傷建模后、以損傷后2 h為時(shí)間截點(diǎn)，隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組(C2組，n=5)、空白對(duì)照組(N組，n=5)和體外轉(zhuǎn)染組(T組，n=5)。

1.2 主要儀器與試劑 2F動(dòng)脈取血栓導(dǎo)管(120602F，愛(ài)德華生命科學(xué)有限公司);DMEM培養(yǎng)液(Hyclone);0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco);胎牛血清(Hyclone);二甲基亞砜(DMSO)、MTT(Sigma);FoxO3a抗體、p-FoxO3a抗體、HA-Tag兔抗單克隆抗體(CST);PCR引物(上海英維捷基貿(mào)易有限公司);質(zhì)粒HA-FoxO3a TM(Addgene、質(zhì)粒號(hào)1788)(圖1);QIAGEN plasmid mini kit(Qiagen、貨號(hào)12125);脂質(zhì)體LipofectAMINETM2000由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

圖1HA-FoxO3a TM質(zhì)粒圖譜

1.3 建立頸動(dòng)脈球囊損傷模型 SD大鼠(按照0.3 ml/100 g體重腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛)麻醉后，將其固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒頸部皮膚、備皮、鋪巾，取頸部正中切口，逐層分離軟組織、暴露頸總動(dòng)脈，用止血鉗鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、左頸內(nèi)、外動(dòng)脈及迷走神經(jīng)，頸總動(dòng)脈近心端與頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處遠(yuǎn)心端分別活結(jié)結(jié)扎，頸外動(dòng)脈分叉處遠(yuǎn)心端死結(jié)結(jié)扎。用顯微外科剪在頸外動(dòng)脈分叉處與結(jié)扎處之間剪一“V”型切口，從左側(cè)頸外動(dòng)脈置入2F取栓導(dǎo)管至左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎處，于球囊內(nèi)注入0.9%生理鹽水以擴(kuò)張球囊，并向遠(yuǎn)心端牽拉導(dǎo)管以剝脫內(nèi)膜，抽去生理鹽水后送回頸總動(dòng)脈內(nèi)。重復(fù)上述操作3次后，退出導(dǎo)管，于頸外動(dòng)脈分叉處和切口之間結(jié)扎，松開(kāi)頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈的活結(jié)，待血供恢復(fù)后，逐層縫合傷口，繼續(xù)以標(biāo)準(zhǔn)飼料按照清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)。

1.4 VSMC的培養(yǎng)和鑒定 取正常的和損傷后的頸總動(dòng)脈血管組織，以組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMC，原代細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。以免疫組織化學(xué)方法、采用來(lái)源于平滑肌細(xì)胞的特異性SMα-actin抗體，鑒定血管平滑肌細(xì)胞。

1.5 RT-PCR檢測(cè)FKHRL-1 mRNA的表達(dá) 收集C1組和S組不同損傷時(shí)間點(diǎn)的VSMC，TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。PCR引物由上海英維捷基貿(mào)易有限公司合成，引物序列：5'-TGCTCACTTCGGACTCGC-3'(上游)、5'-GACATCATTGGGTCGTTGC-3'(下游)，產(chǎn)物長(zhǎng)度為136 bp。內(nèi)參β-actin引物由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院組織工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，產(chǎn)物長(zhǎng)度為592 bp。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min、95℃變性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸45 s、35個(gè)循環(huán)后延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂凝膠電泳2 h后，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析。1.6 Western印跡檢測(cè)FKHRL-1總蛋白及其磷酸化蛋白的表達(dá) 取不同時(shí)間點(diǎn)VSMC，分別加入100 μl組織裂解液(Sigma)和3 μl蛋白酶抑制劑(PMSF)制成勻漿，提取蛋白并檢測(cè)蛋白濃度。10%分離膠上樣10 μl蛋白樣品，80V電泳、繼之400 mA轉(zhuǎn)膜 2 h，5%TBST封閉過(guò)夜;一抗(FoxO3a抗體，1∶1 000;p-FoxO3a 抗體，1∶800)過(guò)夜，洗滌后加二抗(1∶2 000);曝光、顯影。

1.7 VSMC的轉(zhuǎn)染①取球囊損傷后2 h的第3代VSMC，于轉(zhuǎn)染前24小時(shí)胰酶消化制成細(xì)胞懸液、接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上(每孔含1×105/2 ml細(xì)胞懸液);細(xì)胞分三組(6孔板，每組樣本n=3)，C2組(損傷后VSMC不予干預(yù)，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)、N組(陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pECE-GFP(－)、T組(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 HA-FoxO3a TM)。②首先使用Lipofectmaine2000脂質(zhì)體分別對(duì)質(zhì)粒pECEGFP(－)和質(zhì)粒 HA-FoxO3a TM進(jìn)行包裹，充分混勻、靜置20 min以便形成復(fù)合物，后分別加入N組和T組細(xì)胞中、轉(zhuǎn)染VSMCs;待6孔板中溶液分布均勻，將細(xì)胞重新放回恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);倒置顯微鏡下觀察，若VSMC內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)體空泡，說(shuō)明轉(zhuǎn)染完成。③轉(zhuǎn)染后24 h，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液(DMEM+10%FBS)、繼續(xù)培養(yǎng);轉(zhuǎn)染后48 h，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后VSMC中質(zhì)粒蛋白的表達(dá) 取轉(zhuǎn)染后各組的VSMC，具體步驟同前，一抗(HA-Tag，1∶1 000)、二抗(1∶2 000)。

1.8 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖能力 取轉(zhuǎn)染后C2組、N組和T組的損傷后VSMC，于培養(yǎng)后5 d內(nèi)每日檢測(cè)VSMC的增殖能力，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)4個(gè)復(fù)空。吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入5 mg/ml的MTT工作液20 μl，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，小心吸盡上清液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min以溶解結(jié)晶。以酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm波長(zhǎng)的光密度(以無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)液作為調(diào)零)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 VSMC的鑒定及FKHRL-1 mRNA的表達(dá) 經(jīng)來(lái)源于平滑肌細(xì)胞的特異性 SMα-actin鑒定，明確為 VSMC(圖2)。RTPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，在 C1、S1、S2、S3、S4、S5、S6 組中均可見(jiàn)FKHRL-1 mRNA的表達(dá)，約136 bp(圖3)。

圖2 VSMC鑒定(×100)

圖3RT-PCR檢測(cè)VSMC中FKHRL-1 mRNA的表達(dá)

2.2 VSMC FKHRL-1總蛋白及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平

Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，在 C1、S1～6各組中均可見(jiàn)FKHRL-1總蛋白表達(dá)，且S3組可見(jiàn)FKHRL-1磷酸化蛋白的明顯表達(dá)。其中，各S組與C1組在FKHRL-1總蛋白表達(dá)水平上比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);在各S組中，損傷后S1組和S2組中FKHRL-1磷酸化蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，直至S3組(損傷后2 h)可見(jiàn)FKHRL-1磷酸化蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，與其他組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而在S4組、S5組中FKHRL-1磷酸化蛋白水平呈逐漸下降趨勢(shì)，至S6組中磷酸化蛋白則呈低表達(dá)見(jiàn)圖4，表1。

2.3 VSMC轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)

表1 Western印跡檢測(cè)VSMC中FKHRL-1總蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá)

2.3.1 熒光倒置顯微鏡下觀察 轉(zhuǎn)染后N組中VSMC生長(zhǎng)形態(tài)良好，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)綠色熒光分布，且隨著轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，綠色熒光分布逐漸密集，證明攜帶有基因GFP的空載質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入VSMC內(nèi)，并表達(dá)綠色熒光蛋白(圖5)。

圖4Western印跡檢測(cè)VSMC FKHRL-1總蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá)

圖5 空白對(duì)照組轉(zhuǎn)染后VSMC形態(tài)(×200)

2.3.2 轉(zhuǎn)染后VSMC中質(zhì)粒蛋白的表達(dá)水平 在正常對(duì)照組(C2組，0.002)和空白對(duì)照組 (N組，0.004)的VSMC中，質(zhì)粒HA-FoxO3a TM的標(biāo)記蛋白HA-Tag呈現(xiàn)極低表達(dá);而在體外轉(zhuǎn)染組 (T組，0.642)中，可見(jiàn)標(biāo)記蛋白HA明顯表達(dá)增強(qiáng)，與C組、N組之間存在顯著性差異 (P＜0.01)，提示脂質(zhì)體成功將帶有HA-FoxO3a TM基因片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入VSMC中(圖6)。

圖6 轉(zhuǎn)染后質(zhì)粒蛋白的表達(dá)

2.3.3 FKHRL-1轉(zhuǎn)染對(duì)VSMC增殖能力的影響 應(yīng)用MTT法比較各組間VSMC的增殖能力，與正常對(duì)照組(C2組)相比，體外轉(zhuǎn)染組(T組)VSMC的OD值明顯降低，提示轉(zhuǎn)染前后VSMC增殖能力的變化差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而空白對(duì)照組(N組)與正常對(duì)照組(C2組)之間，VSMC的增殖能力比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 各組間VSMC增殖能力比較

3討論

隨著對(duì)再狹窄分子生物學(xué)機(jī)制的認(rèn)識(shí)與研究的深入，以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因被發(fā)現(xiàn)參與到VSMC的增殖過(guò)程中。通過(guò)阻斷上述基因的表達(dá)以抑制VSMC的增殖、減輕內(nèi)膜的增生〔3〕，成為了未來(lái)解決再狹窄問(wèn)題的突破點(diǎn)之一。

所謂基因治療，就是應(yīng)用基因工程和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，將功能正常的基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中，通過(guò)導(dǎo)入的基因表達(dá)，使得靶細(xì)胞獲得特定的功能、補(bǔ)充丟失或缺失的正常功能蛋白質(zhì)、或者抑制體內(nèi)基因的過(guò)盛表達(dá)，從而達(dá)到治療目的。傳統(tǒng)意義上的基因治療是指外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，與細(xì)胞染色體基因組發(fā)生整合，成為宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的一部分，外源基因表達(dá)產(chǎn)物起到對(duì)疾病的防治作用。近年來(lái)，隨著基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的發(fā)展，外源基因?qū)牒蟛⒉话l(fā)生整合，而在染色體外表達(dá)基因產(chǎn)物，或者僅僅導(dǎo)入反義核苷酸抑制特定基因的表達(dá)，同樣能發(fā)揮治療效果。

基因治療的關(guān)鍵和基礎(chǔ)就是基因轉(zhuǎn)染，使其能夠安全、真實(shí)、長(zhǎng)效地表達(dá)。通?；蜣D(zhuǎn)染的載體可分為兩大類：病毒載體和非病毒載體。腺病毒載體由于其轉(zhuǎn)染能力強(qiáng)曾被廣泛應(yīng)用，但由于轉(zhuǎn)染時(shí)可以復(fù)原為致病性的野生型腺病毒、具有細(xì)胞毒性和免疫原性，實(shí)際應(yīng)用受到許多限制〔4〕。非病毒載體，如陽(yáng)離子脂質(zhì)體、陽(yáng)離子類脂質(zhì)體和聚合物等，具有許多優(yōu)勢(shì)，如價(jià)格低廉、無(wú)致炎性和免疫原性、良好的生物相容性、安全性高、重復(fù)性好。近年來(lái)研發(fā)的陽(yáng)離子脂質(zhì)體(如本實(shí)驗(yàn)選用的Lipofectamin 2000)，對(duì)基因片段代謝大小限制較少、轉(zhuǎn)染過(guò)程相對(duì)無(wú)害，當(dāng)它與質(zhì)粒DNA混合后即可自動(dòng)形成包裹DNA的脂質(zhì)體顆粒，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)選擇上述陽(yáng)離子脂質(zhì)體為載體，將目的基因(HA-FoxO3a TM)轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的球囊損傷后VSMC中。轉(zhuǎn)染治療后通過(guò)Western印跡法檢測(cè)質(zhì)粒DNA標(biāo)記蛋白的表達(dá)，以及熒光顯微鏡下觀察到陰性轉(zhuǎn)染后VSMC內(nèi)的大量綠色熒光分布、而正常對(duì)照組中均未見(jiàn)綠色熒光分布和蛋白表達(dá)，提示脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染方式成功。

研究證實(shí)〔5〕，F(xiàn)KHRL-1可使細(xì)胞周期停滯在G1-S和G2-M期“限制點(diǎn)”，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，具有上游調(diào)控作用并且在分化晚期調(diào)控基因表達(dá)，還可使細(xì)胞對(duì)凋亡刺激敏感性增強(qiáng)。同時(shí)人們提出，F(xiàn)KHRL-1的上游活性通路是一個(gè)磷酸化與乙?；碾p重調(diào)節(jié)機(jī)制。目前認(rèn)為，F(xiàn)KHRL-1的磷酸化修飾是該轉(zhuǎn)錄因子最常見(jiàn)、最重要的上游調(diào)控通路，哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在著多條信號(hào)通路共同發(fā)揮著上述作用，促使FKHRL-1磷酸化而發(fā)生核排斥、滯留于細(xì)胞質(zhì)中，從而活性受到抑制。我們?cè)谇捌诘难芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)〔6〕，血管損傷后，血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)FKHRL-1快速發(fā)生磷酸化且持續(xù)時(shí)間短，磷酸化的高峰在損傷后12 h內(nèi)出現(xiàn)，并伴隨血管平滑肌細(xì)胞增殖能力的顯著升高。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面提示非磷酸化FKHRL-1的含量升高可能在抑制VSMC增殖過(guò)程中發(fā)揮作用;另一方面也提示通過(guò)基因轉(zhuǎn)染方式抑制血管損傷后修復(fù)過(guò)程的可行性。

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