方 莉，陳紹蘭，蔡 燕，蔣 紅，黃光成，楊明輝，唐 中△

(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系，四川南充 637000；3.川北醫(yī)學院風濕免疫研究所，四川南充 637000)

白血病(leukemia)是臨床上常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，是嚴重危害人類健康的惡性疾病之一，近年發(fā)病率呈上升趨勢，在兒童中尤為明顯。有關(guān)白血病的治療和發(fā)病機制研究一直很受關(guān)注。隨著骨髓移植、靶向性治療等手段應用，已使白血病的緩解率大大提高，部分病例甚至可治愈。但目前白血病的治療仍以化療為主，而化療藥物的非特異細胞毒性，在殺傷白血病細胞的同時，不加選擇地對正常造血細胞和組織細胞造成損害，引起嚴重的不良反應。近年來，國內(nèi)外學者對葡萄原花青素(grape procyanidins,GPC)進行了大量實驗，研究表明GPC在預防和治療人類疾病方面有獨特的作用[1-2]。本研究以GPC對人白血病細胞(HL-60細胞)的凋亡作用進行研究，以期為GPC治療白血病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基購于Gibco公司；小牛血清購于杭州四季青公司；熒光素標記的連接素Ⅴ(AnnexinⅤ-fluoresein isothiocyanate,Annexin V-FITC) 和碘化吡啶(propidium iodide,PI) 雙染凋亡檢測試劑盒購于嘉美生物有限責任公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于成都科龍化工試劑廠；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅鹽(MTT)為ATD公司產(chǎn)品；提取GPC的釀酒葡萄皮渣來源于河北省昌黎縣鳳凰酒莊，采用60%乙醇溶劑浸提法提取，紫外分光光度計測定，pH值示差法計算提取率，用DA-201型大孔吸附樹脂純化；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；HL-60細胞系本院風濕免疫研究所傳代保存。

1.2主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Heal Force HF90)、生物安全柜(Heal Force HFSAFE-120)、電子分析天平(AW320)、酶標儀(Benchmark BIO-RAD)、流式細胞儀(BECKMAN XL-MCL)、冷凍離心機(ILettich UNIVERSAC 16R)、低速離心機、熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS CK40)、水平搖床、加樣槍、96孔板、12 孔板、一次性濾器。

1.3試劑配制

1.3.1GPC的配制 準確稱取GPC 500 mg于燒杯中，加入10 mL二甲基亞砜(DMSO)稀釋，配制成濃度為50 mg/mL的GPC母液，0.22 μm濾膜過濾后，分裝入干凈玻璃瓶中，4 ℃避光保存。

1.3.2MTT 準確稱取MTT 250 mg于燒杯中，加入0.01 mol/L，pH 7.4的PBS 50 mL稀釋，配制成濃度為5 mg/mL的MTT溶液，0.22 μm濾膜過濾后，分裝入干凈玻璃瓶中，4 ℃避光保存。

表1 GPC對HL-60細胞增殖抑制率的影響

-：表示此項無數(shù)據(jù)。

1.4細胞培養(yǎng)

1.4.1復蘇細胞 調(diào)節(jié)水浴箱溫度為41 ℃，并提前在試管內(nèi)放置10倍培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液溫度與室溫一致。1 min內(nèi)融化細胞，移取至試管內(nèi)，1 000 r/min，離心5 min，棄上清液。

1.4.2細胞培養(yǎng) 加入含10 %小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，并加入雙抗(100 IU/mL青霉素，100 IU/mL鏈霉素)。37 ℃、體積分數(shù)為5 %的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察細胞，如有抱團現(xiàn)象則換液，2～3 d，傳代1次。

1.5MTT法檢測細胞增殖抑制率 收集對數(shù)生長期HL-60細胞，加入含10 %小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL左右。種3個96孔板，每板設(shè)1個實驗對照組和5個藥物濃度實驗組，以及1個空白對照組和5個藥物濃度空白對照組，每組設(shè)6個復孔；其中實驗對照組和5個藥物濃度實驗組每孔加入100 μL細胞濃度為1×105/mL的培養(yǎng)液，空白對照組和5個藥物濃度空白對照組每孔加入含10 %小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基100 μL。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞。實驗對照組和空白對照組每孔加入含10 %小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基100 μL；5個藥物濃度實驗組和5個藥物濃度空白對照組分別加入GPC藥物濃度為200、400、600、800、1 000 μg/mL的培養(yǎng)基100 μL，使孔內(nèi)藥物濃度分別為100、200、300、400、500 μg/mL。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察。

每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。1 000 r/min，離心5 min，小心吸掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處(630 nm校準)測量各孔的吸光值(OD)。增殖抑制率=1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期 收集對數(shù)生長期HL-60細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105/mL，接種于兩個12孔板，每孔500 μL，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。實驗對照組加入含10 %小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基500 μL，5個藥物實驗組分別加入GPC藥物濃度為200、400、600、800、1 000 μg/mL的培養(yǎng)基500 μL，每組設(shè)4個復孔，使孔內(nèi)藥物濃度分別為100、200、300、400、500 μg/mL，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育。將各孔內(nèi)細胞轉(zhuǎn)入流式管中，1 000 r/min，離心5 min，棄培養(yǎng)基。用4 ℃預冷的PBS重懸細胞1次，1 000 r/min，離心5 min，棄上清。用去離子水將10×Binding Buffer稀釋成1×Binding Buffer，每管加入300 μL 1×Binding Buffer懸浮細胞。Annexin V-FITC標記： 加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光，室溫孵育15 min。PI標記：加入5 μL PI后輕輕混勻，避光，室溫孵育5 min。補加300 μL 1×Binding Buffer。用流式細胞儀檢測正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1MTT法檢測HL-60細胞增殖抑制率結(jié)果 不同藥物濃度的實驗組處理24、48、72 h后細胞增殖抑制率見表1；隨著GPC藥物濃度的增加，其對HL-60細胞的增殖抑制率逐漸增高，呈時間-劑量依賴效應關(guān)系，見圖1。

圖1 GPC對HL-60細胞增殖率的影響

2.2HL-60細胞凋亡的檢測 HL-60細胞經(jīng)不同濃度的GPC處理24 h，用流式細胞儀檢測GPC誘導的HL-60細胞凋亡；結(jié)果顯示，GPC在低濃度(200 μg/ mL)時可引起少量的細胞發(fā)生凋亡。隨著濃度的增加，GPC的細胞凋亡率也在不斷增加，呈明顯的量效關(guān)系。見圖2。

圖2 GPC對HL-60細胞凋亡的影響

3 討 論

目前白血病的治療仍以化療為主，引起嚴重的不良反應，因此尋找新的不良反應小的抗白血病藥物非常重要。從天然植物中尋找毒性低、療效高，與其他化療藥物配伍使用的抗癌活性成分是抗腫瘤藥物的重要來源之一。這些抗癌活性成分可提高抗腫瘤藥物的抗腫瘤活性或降低其毒性，且其本身也具有一定的抗腫瘤活性，具有廣闊的應用前景。

GPC由不同數(shù)目的黃烷-3-醇或黃烷-3,4-二醇聚合而成。GPC廣泛存在于葡萄、山楂、松樹、銀杏、花生、番荔枝、野草莓、可可豆等植物中，尤其以葡萄皮、籽中含量最多。近年來，國內(nèi)外許多學者的研究表明，GPC在預防和治療人類疾病方面有獨特的作用。Eng等[3]從紅葡萄酒中提取出GPC的B二聚體，發(fā)現(xiàn)這種成分可以使實驗鼠的乳腺癌瘤變小。用紅葡萄酒中提取的GPC的B二聚體對乳腺癌不如人工合成藥物的效果明顯。Shih等[4]研究發(fā)現(xiàn)，GPC不僅可以抑制胃腺癌細胞的增殖，而且可以誘導其凋亡。Chen等[5]發(fā)現(xiàn)桑葚中的花青素矢車菊-3-葡萄糖甙和矢車菊-3-蕓香甙對人類肺癌細胞A549的轉(zhuǎn)移和入侵具有阻止作用。Feng等[6]發(fā)現(xiàn)黑樹梅中的花青素矢車菊-3-蕓香甙對血癌細胞HL-60有殺滅作用而對正常細胞無影響。殺滅作用機制為矢車菊-3-蕓香甙刺激JNK激酶，由JNK激酶蛋白調(diào)節(jié)癌細胞的凋亡程序而殺死癌細胞。國內(nèi)學者研究發(fā)現(xiàn)，GPC具有抗氧化、抗自由基損傷、抗突變、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗衰老、保護心血管系統(tǒng)等多種生理、藥理功效[7]。多項實驗研究表明，GPC體外對前列腺癌細胞[8-9]，人肝癌細胞[10-11]， 肺癌細胞[12]等都有明顯的增殖抑制和誘導腫瘤細胞凋亡的作用，張海暉等[13]同時研究了蓮房GPC對肺癌LETP-2細胞、胃腺癌SGC-7901細胞、黑色素瘤A375細胞的作用，得出蓮房GPC體外對此3種細胞均有顯著性抑制作用。池余剛等[14]還通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)GPC可以明顯降低survivin的mRNA和蛋白水平的表達，可能通過降低survivin的表達，在體外抑制SKOV3細胞增殖，并促進其凋亡。高愛霞等[15]的體內(nèi)研究表明GPC能明顯抑制肺癌細胞NCI-H460細胞的增殖、誘導細胞凋亡和抑制裸鼠腫瘤的生長。雖然現(xiàn)在國內(nèi)外在GPC對白血病細胞，特別是HL-60細胞的作用研究還很少，但從上述研究中可以看出，GPC在對腫瘤細胞的增殖抑制和促凋亡作用是非常明顯的，這也為作者提供了大量的參考資料和實驗依據(jù)。

本研究采用MTT法檢測細胞增殖抑制率，通過實驗結(jié)果可以看出，不同濃度GPC對HL-60細胞的生長具有明顯的抑制作用，隨著GPC濃度的增加和作用時間的延長，其對HL-60細胞增殖抑制率逐漸升高，GPC可顯著抑制HL-60細胞體外生長，并呈時間-劑量效應；同時Annexin V-FITC和PI雙染，采用流式細胞術(shù)檢測以不同濃度GPC作用24 h后HL-60細胞的凋亡，發(fā)現(xiàn)GPC具有誘導HL-60細胞凋亡的能力，并且隨著GPC藥物濃度的增加， HL-60細胞發(fā)生凋亡的比例也隨之增加。

綜上所述，葡萄皮渣中提取的GPC在體外可明顯抑制增殖HL-60細胞的增殖并誘導其凋亡，且抑制細胞增殖作用呈時間-劑量依賴效應。GPC為白血病治療的新藥物選擇提供了新的參考，但尚需進一步研究其抗腫瘤的機制及其在體內(nèi)的詳細藥理過程。

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