何建國，鄧揚(yáng)嘉，唐文淵，錢冠華，丁嵩濤，彭惠民△

(1.重慶市紅十字會醫(yī)院 400020；2.重慶市第一人民醫(yī)院ICU 400011；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科 400016；4.重慶醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室 400016；5.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心 400016)

顱腦損傷后出現(xiàn)繼發(fā)性缺血、缺氧、細(xì)胞因子釋放等一系列病理過程，神經(jīng)元能量衰竭，同時伴有細(xì)胞內(nèi)各種生化變化。線粒體是細(xì)胞質(zhì)中(細(xì)胞損傷)惟一含有DNA的細(xì)胞器，當(dāng)處于缺血缺氧性顱腦損傷狀態(tài)時，線粒體DNA (mitochondrial DNA,mtDNA)易發(fā)生突變，因而線粒體是顱腦損傷的亞細(xì)胞目標(biāo)。目前，亞低溫已較為廣泛的應(yīng)用于臨床，被證實起到了一定的腦保護(hù)作用，但其具體機(jī)制尚不清楚。本研究在亞低溫治療重型顱腦損傷動物模型上，探討亞低溫對顱腦損傷后不同時段神經(jīng)細(xì)胞mtDNA缺失及缺失DNA所編碼的酶活性變化的影響，探討最佳治療時機(jī)。

1 材料與方法

1.1重型顱腦損傷及亞低溫治療重型顱腦損傷動物模型的建立 重型顱腦損傷及亞低溫治療重型顱腦損傷動物模型的建立參照參考文獻(xiàn)[1]。

1.2實驗動物分組 普通型SD大鼠225只，雌雄不限，體質(zhì)量300～350 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)分為正常組，損傷后6、12、24、48、72、96、120 h組，降溫6、12、24、48、72、96、120 h組，共15組，每組15只。

1.3腦細(xì)胞線粒體的制備[2]在無酶條件下稱取大鼠腦組織100 mg在勻漿介質(zhì)IM1(0.25 mmol/L蔗糖，1 mmol/L EDTANa2，50 mmol/L Tris-HCl,pH=7.5)中勻漿，將勻漿以1 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液以15 000×g，4 ℃離心15 min，沉淀即為線粒體，移入IM2中―30 ℃保存。提取的線粒體送電鏡檢查，證實為線粒體，其內(nèi)包含少許膜小體，見圖1。

1.4PCR檢測mtDNA的缺失 引物序列按照大鼠mtDNA全序列設(shè)計[3]，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。(1)下列引物位于mtDNA的無缺失區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物657 bp,引物1：L15758-15777,5′-ACA GGC ATC TGG TTC TTA CT -3′;引物2：H117-98,5′-CAT GTC TAA TCT TAC CTC CA-3′。(2)下列引物橫跨mtDNA常見的缺失區(qū)，5 430 bp擴(kuò)增產(chǎn)物為正常mtDNA，409 bp擴(kuò)增產(chǎn)物為缺失型mtDNA，引物3：L7687-7709，5′-GCT TAG AGC GTT AAC CTT TTA AG-3′；引物4：H13117-13099，5′-AAG CCT GCT AGG ATG CTT C-3′。提取大鼠腦細(xì)胞mtDNA，按杭州維特潔生化技術(shù)有限公司提供的血細(xì)胞/培養(yǎng)細(xì)胞基因組DNA制備試劑盒的說明操作。擴(kuò)增后均能見到409 bp及5 430 bp兩條帶，但為了去除5 430 bp帶對409 bp帶的影響，以TaqⅠ酶切模板mtDNA，酶切位點位于TCGA(5′-T/ CGA-3′)。以經(jīng)過上述酶切過程的模板mtDNA加入相同的擴(kuò)增缺失mtDNA的反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件同前，擴(kuò)增409 bp產(chǎn)物。確認(rèn)并分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果用Microtec ScanMaker E6系統(tǒng)掃描，輸入Image Master VDS Software 2.0圖像采集及分析系統(tǒng)軟件包進(jìn)行分析，測定代表mtDNA缺失的條帶(409 bp處的擴(kuò)增產(chǎn)物)和與之同一時段代表線粒體總DNA條帶(657 bp處的擴(kuò)增產(chǎn)物)的絕對積分光密度(OD)值，結(jié)果以409 bp處的擴(kuò)增產(chǎn)物的絕對積分OD值用與之配對的657 bp處的擴(kuò)增產(chǎn)物絕對積分OD值的比值表示。將酶切后經(jīng)PCR擴(kuò)增的409 bp帶處的瓊脂糖凝膠切割、純化、回收。

1.5神經(jīng)細(xì)胞線粒體Na+-K+-ATP酶、細(xì)胞色素氧化酶活性 Na+-K+-ATP酶測試盒(南京建成生物工程研究所)測定大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞線粒體Na+-K+-ATP酶活性。細(xì)胞色素C氧化酶活性測定試劑盒(Sigma公司)測定大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素氧化酶活性。操作方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠不同時間段腦神經(jīng)細(xì)胞mtDNA的缺失 損傷及降溫各組的缺失/總mtDNA的比值較正常組均明顯升高(P<0.05)。損傷6、12、24、48 h組及降溫6、12、24、48 h組的缺失/總mtDNA的比值均呈逐漸上升趨勢，但降溫6、12、24、48 h組的該比值低于相應(yīng)時間的損傷組(P<0.05)；72 h后該比值到達(dá)一平臺期，且降溫72、96、120 h組與相應(yīng)時間的損傷組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖2。

2.2各組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素氧化酶活性的比較 損傷及降溫各組細(xì)胞色素氧化酶活性較正常組均明顯下降(P<0.05)。損傷6、12、24、48 h組及降溫6、12、24、48 h組的細(xì)胞色素氧化酶活性均呈逐漸下降趨勢，但降溫6、12、24、48 h組該酶活性高于相應(yīng)時間的損傷組(P<0.05)。損傷72、96、120 h組及降溫72、96、120 h組呈逐漸恢復(fù)回升趨勢，但相同時間的損傷組和降溫組該酶活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞缺失/總mtDNA的比值、線粒體細(xì)胞色素氧化酶、Na+-K+-ATP酶的活性

☆：P<0.05,與正常組比較；△：P<0.05，與相同時間的損傷組比較。

2.3各組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞線粒體Na+-K+-ATP酶活性的比較 損傷及降溫各組Na+-K+-ATP酶活性較正常組均明顯下降(P<0.05)。損傷6、12、24、48 h組及降溫6、12、24、48 h組的Na+-K+-ATP酶活性均呈逐漸下降趨勢，但降溫6、12、24、48 h組該酶活性高于相應(yīng)時間的損傷組(P<0.05)。損傷72、96、120 h組及降溫72、96、120 h組中該酶活性呈一平臺期，但相同時間的損傷組和降溫組該酶活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖1 大鼠腦組織中提取的線粒體，內(nèi)有少量

A：正常mtDNA；B：缺失mtDNA；M：Marker。

圖2降溫各組酶切后的正常和缺失mtDNA瓊脂糖電泳圖

3 討 論

線粒體是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵部位，缺血缺氧性顱腦損傷造成mtDNA缺失，對細(xì)胞生化功能影響非常大。而mtDNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯需要在核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下才能完成。在神經(jīng)元發(fā)生缺血時，神經(jīng)細(xì)胞核DNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯受到影響，因此其所編碼的蛋白質(zhì)和調(diào)控因子也會發(fā)生改變，進(jìn)而影響了mtDNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯。有學(xué)者報道，在前腦缺血3.5 min后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元mtDNA的表達(dá)呈選擇性和進(jìn)行性降低[4]。腦組織急性缺血和缺血-再灌注均可引起mtDNA的缺失[5]。點突變和缺失突變是mtDNA突變的兩種主要形式。mtDNA缺失堿基片段通常在1.3～7.6 kb,所謂“普通缺失”。此缺失在8 482位堿基至13 459位堿基之間，共缺失4 977堿基，包括編碼部分ATP合酶亞單位8、ATP合酶亞單位6和細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅲ以及ND1～ND5基因[6]。大鼠mtDNA與人類mtDNA相似，也存在類似的缺失，缺失片段為4.8 kb[7]。腦組織缺血缺氧后，神經(jīng)元將經(jīng)過一個毒性級聯(lián)反應(yīng)，開始于能量障礙，mtDNA可能受到多種因素的損害。另外，在線粒體氧化磷酸化過程中，大約有1%～4%的攝入氧轉(zhuǎn)化為氧自由基。氧自由基電子傳遞系統(tǒng)溢出，最易損傷mtDNA，其易損傷程度高于核DNA的16倍以上，可引起mtDNA發(fā)生片段缺失。

腦組織高度依賴有氧代謝保持離子平衡、膜穩(wěn)定性、神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)完整。mtDNA缺失，將直接影響ATP酶和細(xì)胞色素C氧化酶的活性。而細(xì)胞色素C氧化酶是呼吸鏈的終端酶，為傳遞電子復(fù)合物Ⅳ，在細(xì)胞的有氧代謝和氧化磷酸化耦聯(lián)中起著重要作用，是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性代謝的標(biāo)志。

另外，NO及其衍生物抑制細(xì)胞線粒體呼吸鏈或競爭性地抑制細(xì)胞色素氧化酶[8-9]。而細(xì)胞色素氧化酶是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性代謝的標(biāo)志。本實驗觀察到大鼠腦組織線粒體的細(xì)胞色素氧化酶活性在損傷72 h內(nèi)呈下降趨勢，可以推斷腦組織的能量障礙已開始加重。腦組織ATP的形成主要依賴葡萄糖的有氧分解，而生物體90%分子氧的消耗過程都在細(xì)胞色素氧化酶處完成。當(dāng)細(xì)胞色素氧化酶活性降低后，ATP合成將減少，使原已存在的能量匱乏更加嚴(yán)重，導(dǎo)致ATP酶活性進(jìn)一步下降。

近些年來，有關(guān)亞低溫在顱腦損傷中的研究很多。已有一些研究證明其具有一定的臨床療效[10-14]。本實驗觀察到在損傷72 h內(nèi)大鼠腦組織缺失/總mtDNA的比值明顯升高、組細(xì)胞色素氧化酶活性和Na+-K+-ATP酶活性明顯降低。降溫6、12、24、48 h組與損傷6、12、24、48 h組比較，缺失/總mtDNA的比值明顯降低、細(xì)胞色素氧化酶活性和Na+-K+-ATP酶活性明顯升高。而損傷72、96、120 h組與降溫72、96、120 h組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。說明亞低溫治療在72 h內(nèi)，能夠緩解mtDNA的缺失突變，由mtDNA參與編碼的細(xì)胞色素氧化酶、Na+-K+-ATP酶活性在此階段也有所上升。但72 h之后，mtDNA的缺失已進(jìn)入一平臺期，亞低溫治療對其影響不大，Na+-K+-ATP酶活性也無顯著變化。從而證實了，亞低溫治療在一定的時間范圍內(nèi)(損傷72 h內(nèi))對大鼠顱腦損傷的腦線粒體能量代謝障礙和mtDNA缺失有保護(hù)作用。

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