蔣國紅，黃良國，施迎兵

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州遵義 563003)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是人類的常見病和多發(fā)病，其以較高的發(fā)病率、致殘率和病死率嚴(yán)重地影響著人類的健康。細(xì)胞凋亡是出血性顱腦損傷的重要機(jī)制之一[1]。胱天蛋白酶3(caspase-3)是目前已知的促凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用[2]；而熱休克蛋白70(heat shock proteins 70，HSP70)則作為一種細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)蛋白，發(fā)揮著抑制細(xì)胞凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)擬探討白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)對這兩種蛋白在腦出血大鼠腦內(nèi)表達(dá)的影響，為臨床治療腦出血提供新思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康SD大鼠96只，清潔級，雌雄不拘，體質(zhì)量250～300 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心提供[許可證號SCXK(渝)2007-0005]。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組(N組，n=6)，模型組(M組，n=30)，IL-10低劑量組(L組，n=30)，IL-10高劑量組(H組，n=30)。除正常組外，其余各組分為造模后6 h、12 h、1 d、3 d及7 d 這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選擇6只大鼠進(jìn)行檢測。

1.2主要儀器與試劑 大鼠腦立體定位儀(日本SETAGAYA-KU.TOKY)，圖像處理顯微鏡(德國LEICA-DM 1000)，石蠟切片機(jī)(德國LEICA-RM-2145)，IL-10(英國PeproTech EC公司)，VII型膠原酶(美國Sigma BioScience公司)，caspase-3及HSP70試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.2.1模型制備和給藥方法 實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀。局部消毒后“T”字形剪開顱頂皮膚，按《大鼠腦立體定位圖譜》定位尾狀核[3]，向大鼠右側(cè)尾狀核緩慢注入0.5 μL膠原酶，留針10 min后緩慢撥出穿刺針，縫合皮膚，局部消毒。待動物蘇醒后，放回籠內(nèi)飼養(yǎng)，給予正常進(jìn)食進(jìn)水，保持室溫37 ℃左右。N組不做任何處理。其余各組造模成功后，M組術(shù)后3 h以1 mL生理鹽水腹腔注射，以后每天1次； L組術(shù)后3 h將IL-10(5 μg/kg)加生理鹽水至1 mL腹腔注射，以后每天1次；H組術(shù)后3 h將IL-10(30 μg/kg)加生理鹽水至1 mL腹腔注射，以后每天1次。

1.2.2神經(jīng)功能缺損評分 在各組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采用平衡木行走測試進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分[4]。該項(xiàng)目評分標(biāo)準(zhǔn)共分為6個(gè)等級。0分：大鼠能跳上平衡木并在上面移動而不會掉下； 1分：大鼠能跳上平衡木并在上面移動，掉下概率小于或等于50%；2分：大鼠能跳上平衡木并在上面移動，掉下概率大于50%；3分：在健側(cè)肢體幫助下能跳上平衡木，但受累的癱瘓肢體不能幫助其向前移動；4分：大鼠在平衡木上不能移動，但不會掉下；5分：將大鼠放在平衡木上即會掉下。評分越高，神經(jīng)功能缺損越重。

表1 M、L、H組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分比較分,n=6)

▲:P<0.01,與M組比較；☆:P<0.05,☆☆:P<0.01,與L組比較。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)HSP70陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)比較個(gè)，n=6)

-：表示此項(xiàng)無數(shù)據(jù)；▲:P<0.01,與M組比較；☆:P<0.05,☆☆:P<0.01,與L組比較。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)個(gè)，n=6)

-：表示此項(xiàng)無數(shù)據(jù)；▲：P<0.05,▲▲：P<0.01，與M組比較；☆☆:P<0.01,與L組比較。

1.2.3檢測方法 在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)用水合氯醛麻醉大鼠，快速斷頭取腦。沿穿刺針道冠狀面自上向下切開至尾狀核處，可見血腫灶。以穿刺點(diǎn)為中心，冠狀面取厚度5 mm腦組織置于4%多聚甲醛液中固定4 h，脫水后石蠟包埋。以血腫灶為中心制作厚度為4 μm水平位腦組織切片待測。HSP70和caspase-3免疫組織化學(xué)染色嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行。在高倍光鏡下(×400)，每張切片計(jì)數(shù)血腫周邊不重疊5個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能缺損評分 造模1、3、7 d 后，L組與H組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均明顯低于M組(P<0.01)；造模1、3、7 d后，H組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯低于較L組(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2IL-10對血腫周圍組織HSP70表達(dá)的影響 N組血腫周圍組織HSP70表達(dá)很少，其余3組造模6 h后HSP70表達(dá)即有增加，造模1 d達(dá)高峰，之后逐漸下降，造模7 d后仍有較高表達(dá)。造模12 h及1、3、7 d后，H組HSP70表達(dá)高于L組及M組(P<0.05,P<0.01)。造模6、12 h后，L組HSP70表達(dá)與M組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模1、3、7后，L組HSP70表達(dá)明顯高于M組(P<0.01)。見表2，封2圖1～4。

2.3IL-10對血腫周圍組織caspase-3表達(dá)的影響 caspase-3在N組表達(dá)很少，其余3組造模6 h后表達(dá)開始增加，造模1 d達(dá)高峰，之后逐漸下降。造模12 h后，H組與L組caspase-3表達(dá)水平均低于M組(P<0.05，P<0.01)；H組與L組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模1、3、7 d后， D、L、H 3組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3，封2圖5～8。

3 討 論

IL-10是重要的炎癥抑制因子，在體內(nèi)存在多種活性。近年來研究表明IL-10參與了神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程[5]，可為神經(jīng)損傷修復(fù)提供適宜的微環(huán)境[6]，具有神經(jīng)保護(hù)作用[7]。既往研究多集中于缺血性腦血管病方面，對出血性顱腦損傷研究較少。顱腦出血后導(dǎo)致的損傷機(jī)制復(fù)雜，其組織損傷是多因素參與、多途徑進(jìn)行的復(fù)雜過程，目前仍缺乏有效的治療方法。腦出血后會引起系統(tǒng)性的抗炎反應(yīng)，誘導(dǎo)IL-10水平升高，對腦微循環(huán)起保護(hù)作用[8]，但應(yīng)激產(chǎn)生的IL-10不足以抑制腦出血后繼發(fā)炎癥反應(yīng)及凋亡的有害作用[4]。本研究通過應(yīng)用外源性IL-10治療腦出血大鼠，觀察IL-10對HSP70、caspase-3表達(dá)的影響，探討IL-10對出血性腦損傷的腦保護(hù)作用及其機(jī)制。

HSP是一個(gè)龐大的糖蛋白超基因家族，具有分子伴侶、調(diào)控細(xì)胞周期和參與應(yīng)激等廣泛的生物學(xué)功能，對缺血性損傷有保護(hù)作用[9]，其中HSP70在應(yīng)激條件下合成最為迅速。正常情況下，HSP70 mRNA在細(xì)胞內(nèi)有穩(wěn)定表達(dá)，但很快被降解，所以正常腦組織中HSP70 mRNA及蛋白質(zhì)含量極少。在腦出血等應(yīng)急狀態(tài)下，當(dāng)其他蛋白合成受抑制時(shí)，HSP70表達(dá)反而增加[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在腦出血早期HSP70 及caspase-3均有較高表達(dá)，1 d達(dá)高峰，此后逐漸降低。陽性細(xì)胞的細(xì)胞核及胞質(zhì)中均可見到棕黃色、棕色或棕褐色顆粒。應(yīng)用IL-10進(jìn)行干預(yù)后，HSP70表達(dá)更明顯，且有量效關(guān)系，而caspase-3表達(dá)則相反。這表明IL-10與HSP70及caspase-3的表達(dá)存在密切關(guān)系。高表達(dá)的HSP70除起到分子伴侶及對抗內(nèi)源性損傷因子毒性而起到腦保護(hù)作用外，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡也是其重要的腦保護(hù)機(jī)制[11]。HSP70可通過抑制蛋白激酶c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)和P38的活性，抑制capase-3表達(dá)，干擾細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1)結(jié)合，阻斷凋亡小體的形成，從而抑制細(xì)胞凋亡[12]。說明HSP70抗凋亡作用可能是通過抑制caspase-3活性實(shí)現(xiàn)的。

近年來研究表明，caspase家族在凋亡過程中起重要作用。已有許多證據(jù)表明腦細(xì)胞缺血死亡與caspase-3活化有關(guān)。在細(xì)胞凋亡過程中caspases-3處于核心位置，認(rèn)為caspase-3是caspase級聯(lián)瀑布下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，caspase-3的激活可以認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用IL-10干預(yù)后各組caspase-3水平自12 h起開始降低，且隨IL-10劑量增大下降更顯著。這提示腦出血后IL-10升高可能使caspase-3表達(dá)受到抑制，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而起到促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。IL-10對caspase-3抑制作用可能表現(xiàn)為兩方面：(1)IL-10可通過上調(diào)HSP70表達(dá)來抑制caspase-3表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用；(2)IL-10可以直接抑制caspase-3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，認(rèn)為IL-10是一種有效的caspase-3抑制劑，可以抑制caspase-3活性[14]，并通過阻止caspase-3參與由興奮性氨基酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。

神經(jīng)功能恢復(fù)是腦出血治療的最終目標(biāo)，也是評價(jià)藥物療效的重要指標(biāo)。本研究大鼠行為學(xué)評分結(jié)果表明，應(yīng)用IL-10干預(yù)后1、3、7 d L組及H組大鼠運(yùn)動功能較M組明顯改善，而IL-10高劑量組改善更明顯，其分值隨治療時(shí)間的延長而逐漸下降，此變化趨勢與HSP70表達(dá)增加及caspase-3表達(dá)下降的變化結(jié)果相吻合。表明應(yīng)用IL-10可通過上調(diào)HSP70表達(dá)及抑制caspase-3表達(dá)，減少腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而顯著降低腦出血后神經(jīng)功能評分，促進(jìn)腦出血后神經(jīng)功能恢復(fù)。這可能是IL-10對出血性腦損傷的保護(hù)作用機(jī)制之一。

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