潘 超，張 莉，王 玉，2

(1.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009;2.江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 南京 210008;3.南京大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210008)

二妙丸是中醫(yī)用于燥濕清熱的基礎(chǔ)名方，由蒼術(shù)和黃柏兩味藥組成，用于治療濕熱下注，足膝紅腫熱痛，下肢丹毒，白帶，陰囊濕癢等病癥［1］。目前國(guó)內(nèi)約有數(shù)十家制藥企業(yè)生產(chǎn)該品種。收載于《中國(guó)藥典》(2010年版一部)［2］的二妙丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只對(duì)鹽酸小檗堿用薄層色譜掃描法進(jìn)行了含量測(cè)定。由于黃連及小檗屬多種植物中均含鹽酸小檗堿，僅控制鹽酸小檗堿含量不能真實(shí)反映二妙丸的質(zhì)量。

藥材黃柏的主要活性部位含多種生物堿類成分，主要有黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿等，采用高效液相色譜(HPLC)法分別測(cè)定黃柏中部分生物堿含量已見報(bào)道［3-6］，但未見同時(shí)測(cè)定的報(bào)道。本文采用HPLC法同時(shí)測(cè)定二妙丸中上述5種生物堿成分的含量，并測(cè)定了不同廠家不同批次二妙丸中的生物堿含量，為更有效的控制二妙丸的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-10ADVP液相色譜儀、SPD-10AVP檢測(cè)器、SIL-HTA自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10ASVP柱溫箱、LC Solution工作站，日本島津公司;TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)，上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠。

鹽酸巴馬汀(110732-200907)和鹽酸小檗堿(110713-200911)，中國(guó)藥品生物制品檢定所;黃柏堿(RFS-H-100718-03)，成都瑞芬思生物科技有限公司;木蘭花堿(09-2123)和藥根堿，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。黃柏堿、木蘭花堿和藥根堿經(jīng)HPLC面積歸一化法計(jì)算，含量分別為99.39%，98.60%和98.69%。

二妙丸，吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司(批號(hào):A、B、C)和山東方健制藥有限公司(批號(hào):D、E、F)提供。

乙腈、三乙胺為色譜純;其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:phenomenex Luna C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相 A:乙腈，流動(dòng)相 B:0.02 mol/L磷酸二氫鉀-0.2%三乙胺(磷酸調(diào)pH 3.0)，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1;流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Program of Gradient Elution

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成濃度分別為802，206，101，150 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液(S1);取鹽酸小檗堿適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成濃度為1 015 μg/mL的對(duì)照品溶液(S2)，精密吸取S1和S2適量，加甲醇制成黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿濃度分別為 16.04，4.12，2.02，3.00 和 10.15 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液(S3)，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(12:88)50 mL，密塞，稱重，水浴回流0.5 h，放冷，稱重，加流動(dòng)相補(bǔ)足重量，搖勻，10 000 r/min離心 10 min，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按2.2.2項(xiàng)下方法制備缺黃柏的陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

5種生物堿色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按各生物堿峰計(jì)均大于7 000，說(shuō)明5種生物堿在此色譜條件下均得到較好的分離，且峰形對(duì)稱。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取S3、樣品溶液、陰性對(duì)照溶液按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，HPLC圖見圖1，結(jié)果表明，陰性對(duì)照溶液在5種生物堿出峰位置處無(wú)干擾。

圖1 專屬性試驗(yàn)的HPLC圖Fig.1 HPLC Chromatograms of specificity test

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取 S1 0.05，0.1，0.2，0.3，0.5，1.0，1.5和2.0 mL分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列濃度的對(duì)照品混合溶液;精密吸取S2 0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.5 和 5.0 mL 分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列濃度的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。分別精密吸取10 μL，按2.1項(xiàng)色譜條件依次進(jìn)行測(cè)定，以濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程分別為:黃柏堿Y=9 203 X-697，r=0.999 9，線性范圍為3.99 ～159.40 μg/mL;木蘭花堿Y=11 628 X-5 077，r=0.999 4，線性范圍為1.01～40.52 μg/mL;藥根堿 Y=30 468 X-798，r=0.999 9，線性范圍為 0.50 ～20.00 μg/mL;鹽酸巴馬汀Y=35 338 X-608，r=0.999 9，線性范圍為0.65～25.81μg/mL;鹽酸小檗堿Y=29 818 X+46 505，r=0.999 9，線性范圍為 8.81 ～440.51 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取S3，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各組分峰面積的RSD，結(jié)果黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的RSD分別為0.85%，0.28%，0.30%，0.25%和0.11%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品(批號(hào):F)按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，精密吸取供試品溶液 10 μL，分別在 0，2，4，6，8，10，12，14，16，20 和 24 h各進(jìn)樣一次，測(cè)定峰面積，計(jì)算各組分峰面積的RSD，結(jié)果黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的RSD分別為1.18%，1.33%，1.88%，1.44%和0.08%。5種生物堿在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品(批號(hào):F)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，平行測(cè)定6次，結(jié)果黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的平均含量分別為 2.02，0.74，0.23，0.29和13.62 mg/g;RSD分別為1.24%，1.86%，1.34%，1.05%和1.89%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品6份，各0.25 g，精密稱定，分別精密加入一定量的5種生物堿的對(duì)照品溶液，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的平均回收率分別為98.09%，98.04%，99.75%，102.74%和104.84%;RSD分別為1.04%，1.36%，0.14%，1.83%和0.62%。

2.10 樣品含量測(cè)定

按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別測(cè)定兩個(gè)廠家6批二妙丸中5種生物堿的含量，結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

表3 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.3 Contents of five alkaloids in samples

3 討論

二妙丸黃柏藥材的主要活性成分是生物堿類物質(zhì)，其中鹽酸小檗堿含量較高［7］，《中國(guó)藥典》(2010年版一部)的二妙丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只對(duì)鹽酸小檗堿用薄層色譜掃描法進(jìn)行了含量測(cè)定。然而，黃柏、黃連及其它非法定藥材如三顆針(Radix Berberidis)、十大功勞(Folium Mahonicum)等，均富含鹽酸小檗堿。故僅以鹽酸小檗堿含量評(píng)價(jià)二妙丸質(zhì)量，專屬性有所欠缺。且黃柏堿是黃柏的特征性成分，黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀各自有其藥理作用。故在對(duì)二妙丸進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí)，除鹽酸小檗堿外，應(yīng)增加黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀的檢測(cè)。

［1-6，8］，提取溶劑考察了鹽酸-甲醇(1∶100)、醋酸-甲醇(1∶100)、甲醇、90% 甲醇、50%甲醇、10%甲醇、流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(12∶88)，結(jié)果表明鹽酸-甲醇(1∶100)、醋酸-甲醇(1∶100)的酸性太大，不適合提取黃柏堿和木蘭花堿，90%甲醇和甲醇的極性偏小，亦不適合提取極性較大的黃柏堿和木蘭花堿。通過(guò)比較其他3種提取溶劑對(duì)5種生物堿的提取率，流動(dòng)相提取最完全。提取方法考察了加熱回流提取法和超聲提取法，通過(guò)比較不同提取溶劑體積、不同提取時(shí)間下兩種提取方法對(duì)5種成分的提取率，最終確定為加流動(dòng)相50 mL加熱回流提取30 min。

在流動(dòng)相的選擇中，分別嘗試了乙腈-0.5%三乙胺(磷酸調(diào)pH 2.5)、乙腈-0.2%三乙胺-0.2%磷酸、乙腈-0.052 mol/L磷酸二氫鉀-0.2%三乙胺、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀(磷酸調(diào)pH 3.0)、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀-0.2%三乙胺(磷酸調(diào)pH 3.0)5種不同的流動(dòng)相體系。最終確定采用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀-0.2%三乙胺(磷酸調(diào)pH 3.0)為流動(dòng)相，此流動(dòng)相體系使5種生物堿類成分得到有效分離，并且峰形對(duì)稱。在測(cè)定波長(zhǎng)考察中，以文獻(xiàn)［9-10］報(bào)道的345 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)此波長(zhǎng)處藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿檢測(cè)靈敏度高，但黃柏堿和木蘭花堿的吸收很弱;以220 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，黃柏堿有較強(qiáng)吸收，但其他4種生物堿的吸收變?nèi)?而在284 nm波長(zhǎng)處5種成分的檢測(cè)靈敏度均較高，故選用284 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)來(lái)自不同廠家不同批次的二妙丸中5種生物堿的含量同時(shí)進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同廠家不同批次的二妙丸中5種生物堿類成分的含量差別較大，藥材來(lái)源、制劑生產(chǎn)工藝等均可能影響制劑中生物堿的含量。以鹽酸小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿和鹽酸巴馬汀的含量同時(shí)控制二妙丸的質(zhì)量，結(jié)果更加可靠。

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