趙 婷，楊 陽，宋新蕾，黃曉婧，王鳳山，2

(1.山東大學 藥學院生化與生物技術藥物研究所，2.國家糖工程技術研究中心，山東 濟南 250012)

血容量不足常常引起低血壓、器官血流灌注不足，進而引起多器官功能障礙，乃至威脅生命［1］。目前，臨床上針對低血容量癥的治療手段主要是采用血容量擴充藥進行復蘇，常將人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)作為一線容量擴充劑。然而，HSA的臨床應用存在一定局限性，如在感染、外傷或手術等病理情況下，炎性級聯(lián)反應釋放出大量炎性介質(zhì)，引起血管內(nèi)表皮細胞損傷，毛細血管通透性增加，從而加速HSA泄漏，引起組織水腫和灌注下降，使病情惡化［2-3］。

此外，血液來源緊張等原因致使HSA的供應十分緊張，如何解決當前HSA緊缺的問題成為目前研究的一個熱點。許多科研工作者嘗試采用基因重組技術生產(chǎn)白蛋白(rocombinant HSA，rHSA)［4-5］，但是由于HSA臨床應用劑量較大和重組蛋白產(chǎn)率較低等原因，實現(xiàn)高純度、低成本的藥用級rHSA的大規(guī)模生產(chǎn)是個極具挑戰(zhàn)性的課題［6］。目前，就血容量擴充藥這一用途來講，HSA的主要來源仍然是人血漿。

針對以上HSA在某些病理情況下大量輸注血管保留率低，易在血管外池敏感組織聚集，從而引起或加重組織水腫及來源短缺等問題，我們設想采用聚乙二醇(PEG)對HSA進行共價修飾。PEG分子具有巨大的水化體積，與HSA偶聯(lián)后將賦予HSA較大的分子半徑，從而減少血管滲漏，增加外源性輸注的HSA的血管保留率，使其充分發(fā)揮血容量擴充作用;同時PEG修飾能顯著改善蛋白質(zhì)藥物的藥代動力學性質(zhì)［7］，對HSA進行PEG修飾有望延長其生物半衰期，降低用藥頻率，在藥物經(jīng)濟學方面也具有一定意義。

本實驗對以上設想進行了初步驗證，采用氰尿酰氯活化的PEG對HSA進行修飾，圓二色譜法測定HSA及其PEG修飾產(chǎn)物(PEG-HSA)的二級結(jié)構，同時采用脂多糖(LPS)誘導的急性肺損傷模型，考察HSA和PEG-HSA的肺毛細血管滲透性;另外，采用同位素示蹤法研究了PEG-HSA的藥代動力學性質(zhì)。

1 材料

HSA，山東泰邦生物制品有限公司;PEG6000，上海生工生物工程有限公司;LPS、異硫氰酸熒光素(FITC)，Sigma公司;DEAE Sepharose FF，GE 公司;Na125I，中國原子能科學研究院。

Chirascan圓二色譜儀，英國應用光物理公司;AKTA Purifier100蛋白色譜系統(tǒng)，美國 GE公司;IX51倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司;WIZARD Gamma全自動計數(shù)儀，美國PE公司。

昆明種小鼠，山東大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(魯)20090001。

2 方法

2.1 HSA的PEG修飾物的制備

將氰尿酰氯活化的PEG6000與HSA按摩爾比10∶1溶于pH 9.0、10 mmol/L的四硼酸鈉緩沖液中，4℃緩慢攪拌反應10 h，加入過量的甘氨酸終止反應。修飾反應混合物經(jīng)適當稀釋后進行SDS-PAGE分析。

2.2 PEG-HSA的分離純化

采用陰離子交換色譜法(DEAE Sepharose FF)和超濾法分離純化修飾產(chǎn)物。

修飾反應液1 mL加平衡緩沖液5 mL稀釋，0.45 m微孔濾膜過濾后上樣。分離參數(shù)為:流速:5.0 mL/min;上樣體積:5 mL;平衡液:0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.5;洗脫條件:0.1～0.3 mol/L NaCl線性梯度洗脫;檢測波長:280 nm。修飾混合物經(jīng)DEAE Sepharose FF分離洗脫時出現(xiàn)兩個完全分開的洗脫峰，收集洗脫峰，超濾脫鹽，SDS-PAGE檢測純度。

2.3 二級結(jié)構測定

采用圓二色譜法測定HSA和PEG-HSA的二級結(jié)構。分別稱取適量 HSA和 PEG-HSA，溶于pH 7.4，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，使其蛋白終濃度均為 5 μmol/L［8］。所用比色池光程為 0.1 cm，譜帶寬度為1 nm，掃描時間為1 s，室溫下分別測定HSA和PEG-HSA在190～260 nm波長范圍內(nèi)的圓二光譜。

2.4 急性肺損傷模型中的血管滲透性

采用LPS誘導的急性肺損傷為模型，考察HSA和PEG-HSA在肺部毛細血管的滲出。首先對HSA和PEG-HSA進行FITC熒光標記［9］。將昆明小鼠隨機分為3組:對照組(生理鹽水+FITC-HSA)、HSA給藥的模型組(LPS+FITC-HSA)和PEG-HSA給藥的模型組(LPS+FITC-PEG-HSA)，每組4只。小鼠水合氯醛麻醉，LPS的生理鹽水溶液(0.2 mg/mL)50 μL滴鼻給藥誘導急性肺損傷模型，對照組給生理鹽水50 μL。LPS或生理鹽水滴鼻20 min后尾靜脈注射FITC標記蛋白(0.42 mg/kg)。LPS造模后4 h，麻醉小鼠，打開胸腔，剪開右心耳，向左心室內(nèi)灌注生理鹽水，直至右心耳流出清亮液體為止，再灌注10%甲醛固定。取肺組織，冰凍切片，熒光顯微鏡觀察FITC標記的HSA和PEG-HSA在肺組織的分布。

2.5 小鼠體內(nèi)的藥代動力學研究

2.5.1 HSA和PEG-HSA的125I放射性標記及分離純化 采用Iodogen法對蛋白進行放射性碘標記。取涂布好的Iodogen管放置到室溫，于管底加入pH 7.4、0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液 100 μL，而后加入PEG-HSA(8 mg/mL)或 HSA(5 mg/mL)10 μL，迅速于鉛盒內(nèi)取Na125I 2.5 μL加入反應管中，輕輕振搖，待室溫反應20 min后，加入pH 7.4、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液150 μL，混勻，靜置10 min以終止碘化反應。

將Sephadex G-25色譜柱(1.1 cm×27 cm)預先用pH 7.4、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液平衡，上樣后洗脫流速0.3 mL/min，每管收集1 mL。分別取各收集管內(nèi)洗脫液10 μL，置于γ-能譜儀中測定各管的放射性計數(shù)(cpm)，繪制放射性色譜分離曲線。收集蛋白峰，將收集的碘標產(chǎn)物置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 HSA和PEG-HSA在小鼠體內(nèi)藥代動力學和組織分布研究 雄性昆明種小鼠84只，按體重隨機分為2組，分別為HSA組和PEG-HSA組。每只小鼠快速尾靜脈注射給藥100 μL(370 kBq)，給藥后5，20，45 min，1，4，8，12，24，36，48，60，72，84，96 h(14個時間點)眼眶取血0.1 mL，10%三氯乙酸沉淀，2 000 r/min離心10 min，取沉淀于 γ-能譜儀上測定放射性，記錄結(jié)果，計算血藥濃度，使用藥代動力學軟件3p97計算藥物體內(nèi)半衰期等藥代動力學參數(shù)，同時計算每1 mL血液放射性占注射劑量的百分比，繪制給藥時間對血漿蛋白水平曲線。

將時間點1，4，12和24 h的小鼠脫臼處死，解剖取心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪等組織，生理鹽水沖洗，稱重并測定放射性，計算每1 g組織放射性占注射劑量的百分比，比較不同組織中HSA和PEGHSA的分布情況。

3 結(jié)果

3.1 HSA的PEG修飾產(chǎn)物的制備

HSA與PEG偶聯(lián)反應混合物進行SDS-PAGE分析，檢測產(chǎn)物分布，結(jié)果見圖1。未修飾HSA，呈單一條帶;修飾反應混合物在HSA條帶上方出現(xiàn)了新條帶，分子質(zhì)量分布較為廣泛。修飾混合物經(jīng)陰離子交換色譜和超濾進行分離純化，可將未反應HSA和PEG修飾劑除去，獲得PEG-HSA。

3.2 HSA和PEG-HSA的二級結(jié)構

HSA和PEG-HSA的圓二色譜見圖2?？梢姡琀SA與PEG-HSA具有類似的峰形，兩者的幾乎重合，這說明兩者的二級結(jié)構幾乎一致，提示PEG修飾并未影響HSA的二級結(jié)構，較好的保持了HSA分子的結(jié)構。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構是活性的基礎，由此可進一步推斷修飾反應及后續(xù)的分純化等過程不會影響蛋白的生物活性。

圖2 HSA及其PEG修飾產(chǎn)物的遠紫外圓二色譜圖Fig.2 Far-UV CD spectra of HSA and PEG-HSA

3.3 HSA和PEG-HSA的肺毛細血管滲透性

圖3為各實驗組肺組織的熒光顯微照片?？梢?，HSA給藥模型組的熒光強度明顯高于對照組，即該組FITC-HSA的滲出量高于對照組，此結(jié)果提示LPS誘導的急性肺損傷能夠引起肺組織毛細血管通透性增加，造模成功。同時可以觀察到PEGHSA給藥組的熒光強度明顯低于HSA給藥組，PEG-HSA穿透肺毛細血管滲漏進入組織的量低于HSA給藥組。以上結(jié)果提示在毛細血管通透性增加的情況下，PEG修飾能減少HSA透過血管內(nèi)皮滲出進入組織間隙。

3.4 HSA和PEG-HSA的藥代動力學和組織分布

圖4為HSA和PEG-HSA小鼠尾靜脈注射后血漿水平的時間曲線。由圖4可見，HSA和PEG-HSA經(jīng)尾靜脈注射后血漿水平都成指數(shù)下降，與HSA相比，PEG-HSA的消除速率較慢。根據(jù)赤池信息判據(jù)最小原則(Akaike's Information Criterion，AIC)進行房室模型判別，結(jié)果表明小鼠尾靜脈注射給藥HSA和PEG-HSA符合二室模型。按照二室模型法進行擬合得出的主要藥代動力學參數(shù)見表1，其中HSA的消除半衰期(t1/2β)為(10.31±0.43)h，而 PEGHSA的t1/2β為(22.93±1.51)h，延長為未修飾前的2.2倍左右，PEG-HSA的藥時曲線下面積(AUC)和平均保留時間(MRT)都較未修飾前增大，另外，總體清除率也有所降低。以上結(jié)果均提示PEG修飾能夠改善HSA在體循環(huán)的保留率。

圖3 LPS誘導的急性肺損傷模型中HSA和PEG-HSA的肺毛細血管滲透性Fig.3 Pulmonary microvascular permeability of HSA and PEG-HSA in acute lung injury mice

圖4 125I-HSA和125I-PEG-HSA尾靜脈注射小鼠后標記蛋白的血漿水平Fig.4 Plasma level of radiolabeled proteins after a single intravenous administration of125I-HSA or125I-PEG-HSA to normal mice

表1 小鼠尾靜脈注射HSA與PEG-HSA的體內(nèi)藥代動力學參數(shù)(±s)Tab.1 Pharmacokinetic parameters following a single iv bolus injection of125I-HSA or125I-PEG-HSA to mice(±s)

表1 小鼠尾靜脈注射HSA與PEG-HSA的體內(nèi)藥代動力學參數(shù)(±s)Tab.1 Pharmacokinetic parameters following a single iv bolus injection of125I-HSA or125I-PEG-HSA to mice(±s)

與HSA比較:1P＜0.05，2P＜0.011P＜ 0.05，2P＜ 0.01 vs HSA

參數(shù)HSA PEG-HSA AUC/(μg·h/mL) 2.79±0.09 10.07±1.192 t1/2α/h 0.171 ±0.08 3.57±0.342 t1/2β/h 10.31 ±0.43 22.93 ±1.512 CL/(mL/h) 0.39±0.03 0.14±0.012 MRT/h 22.62±0.82 32.13±1.581 Vdss/mL 5.62±0.12 4.12±0.512

HSA與PEG-HSA小鼠體內(nèi)組織分布結(jié)果圖5。從整體趨勢上看，PEG-HSA并未顯示明顯的組織分布特異性，即HSA在修飾后其組織分布特點并未發(fā)生明顯變化，說明PEG修飾并未影響HSA的組織分布規(guī)律。

圖5 HSA和PEG-HSA小鼠尾靜脈注射后1，4，12和24 h的組織分布圖Fig.5 Tissue distribution of HSA and PEG-HSA at 1，4，12，and 24 h time points in normal mice after a single intravenous administration

4 討論

HSA是一個含585個氨基酸殘基的單鏈無糖基化的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為66.5 kD，是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)成分，約占血漿總蛋白的60%。HSA具有重要的生理功能，是維持血液膠體滲透壓的主要成分和運輸內(nèi)源性及外源性物質(zhì)的重要載體。

正常生理條件下，HSA分子在血管內(nèi)和血管外均有分布，每天約有120～145 g HSA穿過血管內(nèi)皮細胞間隙進入組織，而大部分HSA又能被淋巴循環(huán)吸收而返回到血液循環(huán)中。HSA可穿過血管內(nèi)皮上半徑為145 ?的小孔，因此HSA的血管透過率是由分子大小決定的?；谝陨侠碚?，本實驗采用PEG對HSA進行共價偶聯(lián)，利用PEG分子本身巨大的水化體積，增加HSA的分子半徑，使得HSA不易透過血管內(nèi)皮細胞間隙進入組織而保留在血循環(huán)中，即可以避免組織水腫的發(fā)生，又可以充分發(fā)揮HSA的擴充血容量的藥效。同時，PEG修飾能延長蛋白質(zhì)的t1/2，降低用藥頻率，進而緩解人血HSA來源緊缺的問題。

本實驗為在較短時間內(nèi)驗證本課題設想，采用了反應容易進行的隨機修飾策略，HSA分子含有59個賴氨酸，再加上N末端氨基酸，一個HSA分子有60個可與PEG反應的位點，因此導致獲得的PEGHSA分子質(zhì)量分布較為分散，產(chǎn)品質(zhì)量難以控制。為了獲得結(jié)構均一的修飾產(chǎn)物，以后的實驗將嘗試采用定點修飾策略對蛋白進行修飾。本實驗采用圓二色譜測得HSA和PEG-HSA的二級結(jié)構幾乎一致，提示PEG修飾反應及后期的分離純化步驟并未影響HSA的二級結(jié)構。由此可進一步推斷PEG修飾可能不會影響HSA的生物活性包括藥物結(jié)合作用和血容量擴充作用等。

毛細血管通透性增加是急性肺損傷的重要病理特征，研究報道在LPS給藥4 h時肺部毛細血管的通透性明顯增加［9］，我們在LPS給藥4 h后觀察到PEG-HSA的滲出明顯減少，提示PEG修飾能降低HSA的血管透過率，可能是由于PEG與HSA偶聯(lián)后增大了蛋白分子的水化體積，使得HSA不易透過毛細血管內(nèi)皮上的孔隙。

本研究通過同位素示蹤法測得HSA經(jīng)PEG修飾后t1/2延長為原來的2.2倍。HSA在人體內(nèi)的天然t1/2為18～20 d，而外源性輸注的HSA的t1/2則大大縮短。我們推斷PEG-HSA的t1/2延長可能是由于PEG分子的遮蔽效應，阻礙了血管內(nèi)皮表面膜清除劑受體與HSA的結(jié)合，從而減少了HSA的降解，使其具有較長的血管保留時間。

綜上所述，通過PEG修飾的方法能夠延長HSA的t1/2，降低HSA的血管透過性，進而增加其血管保留率，降低用藥頻率，在血管滲透性增加相關疾病的治療方面PEG-HSA有望成為一種優(yōu)良的新型血容量擴充劑。

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