李 艷，張?zhí)?，張鶴云

(南京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210093)

板栗(Castanea mollissima Blume)又名大栗(《浙江天目山藥用植物志》)栗果(《滇南本草》)、栗實(shí)(《新修本草》)等［1］。具有一定的保健功能，本草綱目稱栗果有“補(bǔ)腎益氣，治腰，腳無力;內(nèi)寒腹泄;活血化淤”等功效［2］，中醫(yī)上又把栗子稱為“腎之果”。迄今為止國內(nèi)外對板栗的研究多在化學(xué)成分的鑒定上，對其藥理作用的研究少之又少，尤其是蛋白質(zhì)的研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對板栗中蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行了研究，為板栗"補(bǔ)腎"提供科學(xué)數(shù)據(jù)，為板栗的深度開發(fā)利用提供參考。

1 材料

板栗，由河北省興隆縣提供。

DMEM(批號(hào):NVH0303)，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司;胰蛋白酶(批號(hào):24301316)，AMRESCO;四甲基偶氮唑鹽(MTT)，南京大冶生物科技有限公司;胎牛血清(FBS，批號(hào):8131652)，GIBCO;促肝細(xì)胞生長因子(HGF，批號(hào):20100401)，廣東省藥物研究所制藥廠;寡聚原花色素(OPC)，本實(shí)驗(yàn)室自山楂中提取。

肝癌細(xì)胞HepS細(xì)胞株由中科院上海藥物研究所提供，江蘇省腫瘤研究所培養(yǎng)傳代，本實(shí)驗(yàn)室凍存;小鼠肉瘤S180腹水型腫瘤細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍存。

清潔級昆明種小鼠，雌性，22～35 g，購于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(蘇)2008-0004。

KQ-250DE型數(shù)控超生波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;UV-9100型紫外可見近紅外分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司;DG5033A酶聯(lián)免疫檢測儀，南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限公司生產(chǎn);CO2培養(yǎng)箱，Thermo Forma公司;DY-1001S型電泳儀，南京大學(xué)儀器廠;JD801凝膠電泳圖像分析儀，南京捷達(dá)公司。

2 方法

2.1 板栗蛋白(CAS)的提取純化

板栗破殼去皮，以料水比1∶4打碎，超聲處理1 h后過濾，濾渣重復(fù)操作一次，兩次濾液合并，經(jīng)乙醇沉淀，棄上清，沉淀用水溶解后7 000 r/min離心10 min，留上清，重復(fù)離心3次，收集上清液，加入(NH4)2SO4沉淀蛋白質(zhì)，充分沉淀后，沉淀物用7 000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀用水溶解后裝透析袋透析;收集透析內(nèi)液，6 000 r/min離心10 min，收集上清，沉淀用水溶解后重復(fù)離心3次，合并上清液過大孔樹脂，水洗脫，收集的流出液再上纖維素柱，分別用不同鹽離子強(qiáng)度的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.5，PBS)洗脫，收集蛋白質(zhì)峰。

2.2 CAS的鑒定

提取得到的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳［3］。

2.3 細(xì)胞體外增殖研究

2.3.1 CAS對正常小鼠腎細(xì)胞體外增殖的促進(jìn)作用 無菌條件下，取正常小鼠腎臟于加有D-HK的培養(yǎng)皿中，剪碎，以1∶1比例加入胰蛋白酶，37℃消化30 min，DMEM終止消化，離心去紅細(xì)胞，再用培養(yǎng)液離心(1 500 r/min，5 min)洗兩次，用含有20%FBS的DMEM配制成腎細(xì)胞濃度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，分別加入到2塊96孔板中，每孔80 μL。每塊板均設(shè)一個(gè)無細(xì)胞空白對照孔(加入DMEM 160 μL);DMEM陰性對照組和HGF陽性對照組(終濃度為 20 μg/mL)［4］，每組 8 個(gè)復(fù)孔;CAS 組 5個(gè)濃度，終濃度分別為 1，5，10，20，40 μg/mL，每組16個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24和48 h后各取一塊板，加入5 mg/mL MTT溶液 100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)，4 h 后加入 20%SDS溶液 40 μL/孔，次日用酶標(biāo)儀測定570 nm波長處的吸光度(A)值。重復(fù)3次，每組的復(fù)孔取平均值。

2.3.2 CAS對腫瘤細(xì)胞的體外增殖的抑制作用

2.3.2.1 CAS對肝癌細(xì)胞HepS體外增殖的抑制作用 無菌條件下取接種7～10 d的HepS瘤源小鼠的腹水，DMEM離心(1 500 r/min，5 min)洗滌兩次，用含20%FBS的DMEM配制成肝癌細(xì)胞HepS的濃度為1×106/mL的細(xì)胞懸液，分組及測定方法同2.3.1項(xiàng)，陽性對照組為OPC(終濃度為40 μL/mL)［5］，CAS 組終濃度為 10，20，40，80，160 μg/mL。

2.3.2.2 CAS對小鼠肉瘤S180體外增殖的抑制作用 配制成小鼠肉瘤S180細(xì)胞懸液的濃度為1×105/mL，按2.3.2.1項(xiàng)下操作。

2.4 CAS對免疫細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用

2.4.1 CAS對T細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用 無菌條件下，取正常小鼠胸腺，碾碎，離心去紅細(xì)胞，DMEM(1 500 r/min，5 min)離心洗兩次，配制成T細(xì)胞濃度為5 ×106/mL，接種到 96 孔板，80 μL/孔，設(shè)置一個(gè)不加細(xì)胞的空白孔(加入DMEM 160 μL)。設(shè)5個(gè)濃度的CAS組，每組16個(gè)復(fù)孔，加入相應(yīng)濃度的CAS 80 μL，終濃度分別為 5，10，20，40，80 μg/mL，另設(shè)DMEM陰性對照組，OPC陽性對照組(濃度為40 μg/mL)［5］，各 8 個(gè)復(fù)孔。其余操作同 2.3.1 項(xiàng)。

2.4.2 CAS對B細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用 無菌條件下，取正常小鼠脾臟，按2.4.1項(xiàng)下方法操作，B細(xì)胞濃度為 5×106/mL，CAS組終濃度為 10，20，40，80，160 μg/mL。

2.5 DNA凝膠電泳法測定CAS對肝癌細(xì)胞HepS凋亡的影響

參照林科等［6］的方法進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1 CAS結(jié)構(gòu)的鑒定

用含高鹽離子強(qiáng)度的PBS洗脫時(shí)幾乎沒有蛋白質(zhì)峰，故只將含有低鹽離子強(qiáng)度的PBS洗脫的洗脫液經(jīng)脫鹽處理，濃縮得到CAS樣品［7］，占果實(shí)總質(zhì)量的0.424%。

得到的CAS經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳，得到6條帶，其中最下面的三條比較清楚(圖1)并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明這三條帶為同一種蛋白質(zhì)，并確定為歐栗球蛋白，分子質(zhì)量62 452，由542個(gè)氨基酸組成(圖2)。

圖1 聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳Fig.1 Vertical slab polyacrylamide gel electrophoresis

圖2 歐栗球蛋白分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structure of Castanin

3.2 CAS體外對腎細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用

CAS和HGF均有促進(jìn)腎細(xì)胞增殖的作用，見表1。與DMEM組比較有顯著差異，結(jié)果表明CAS在體外能夠促進(jìn)腎細(xì)胞的增殖。

表1 CAS對小鼠腎細(xì)胞體外增殖的影響(n=3，±s)Tab.1 Promotion of CAS on mouse renal cells proliferation(n=3，±s)

表1 CAS對小鼠腎細(xì)胞體外增殖的影響(n=3，±s)Tab.1 Promotion of CAS on mouse renal cells proliferation(n=3，±s)

與 DMEM 組比較:1P＜0.05，2P＜0.01，3P＜0.001Compared with DMEM group:1P ＜0.05，2P ＜0.01，3P ＜0.001

組 別 濃度/(μg/mL)A 值24 h 48 h DMEM組0.113±0.061 0.149±0.049 HGF組 20 0.174±0.0541 0.211±0.0711 CAS組 1 0.249±0.0743 0.206±0.0901 5 0.164±0.0651 0.205±0.0771 10 0.172±0.0811 0.207±0.0791 20 0.182±0.0931 0.207±0.0841 40 0.207±0.1062 0.221±0.0891

3.3 CAS對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

CAS和OPC均能抑制肝癌細(xì)胞HepS和小鼠肉瘤細(xì)胞S180的增殖見表2～3。與DMEM組相比，有非常明顯差異(P＜0.01)，在HepS中當(dāng)CAS濃度達(dá)到20 μg/mL以及以上濃度時(shí)差異更加顯著(P＜0.001)。在S180細(xì)胞上這種差異表現(xiàn)的也是異常顯著(P＜0.001)，結(jié)果表明 CAS對肝癌細(xì)胞HepS和小鼠肉瘤細(xì)胞S180的增殖有抑制作用。

表2 CAS對小鼠肝癌HepS細(xì)胞增殖的影響(n=3，±s)Tab.2 Inhabition of CAS on mouse hepatoma cell HepS proliferation(n=3，±s)

表2 CAS對小鼠肝癌HepS細(xì)胞增殖的影響(n=3，±s)Tab.2 Inhabition of CAS on mouse hepatoma cell HepS proliferation(n=3，±s)

與對照組比較:1P＜0.01，2P＜0.001Compared with DMEM group:1P ＜0.01，2P ＜0.001

組 別 濃度/(μg/mL)A 值24 h 48 h DMEM組0.687±0.056 0.528±0.043 OPC組 40 0.598±0.0562 0.490±0.0881 CAS組 10 0.536 ±0.0622 0.462±0.0611 20 0.495±0.0742 0.384±0.0962 40 0.429±0.0822 0.376±0.0432 80 0.382±0.0792 0.247±0.0612 160 0.394±0.0622 0.233±0.0812

表3 CAS對小鼠肉瘤S180腹水型腫瘤細(xì)胞增殖的影響(n=3，±s)Tab.3 Inhibition of CAS on proliferation of S180 mouse sarcomaasides tumor cells(n=3，±s)

表3 CAS對小鼠肉瘤S180腹水型腫瘤細(xì)胞增殖的影響(n=3，±s)Tab.3 Inhibition of CAS on proliferation of S180 mouse sarcomaasides tumor cells(n=3，±s)

與對照組比較:1P＜0.001Compared with DMEM group:1P＜0.001

組 別 濃度/(μg/mL)A 值24 h 48 h DMEM組0.720±0.038 0.915±0.055 OPC組 40 0.541±0.0271 0.527±0.0231 CAS組 10 0.637±0.0521 0.683±0.0731 20 0.646±0.0541 0.789±0.0741 40 0.645±0.0501 0.791±0.0561 80 0.640±0.0511 0.792±0.0461 160 0.600±0.0541 0.568±0.0781

3.4 CAS對免疫細(xì)胞體外增殖作用的影響

CAS和OPC在體外對免疫細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，見表4～5。結(jié)果表明，與DMEM組相比，CAS對免疫細(xì)胞的增殖有較顯著的促進(jìn)作用。

3.5 DNA凝膠電泳法測定CAS對肝癌細(xì)胞HepS凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖3)，160 μg/mL沒有小分子質(zhì)量的DNA片段，顯示大部分細(xì)胞已死亡;其他5組與空白對照組相比，有較多的小分子DNA條帶且形成“Ladder”，大分子質(zhì)量較少，說明細(xì)胞內(nèi)的大部分DNA已降解成分子質(zhì)量為核小體整數(shù)倍的DNA梯形片段，而對照組主要為大分子DNA。結(jié)果表明4個(gè)劑量的CAS及陽性對照OPC對肝癌細(xì)胞HepS的凋亡有顯著促進(jìn)作用。

表4 CAS對小鼠T細(xì)胞體外增殖的影響(n=3，±s)Tab.4 Effect of CAS on mouse thymus cells proliferation(n=3，±s)

表4 CAS對小鼠T細(xì)胞體外增殖的影響(n=3，±s)Tab.4 Effect of CAS on mouse thymus cells proliferation(n=3，±s)

與對照組比較:1P＜0.05，2P＜0.01，3P＜0.001Compared with DMEM group:1P ＜0.05，2P ＜0.01，3P＜0.001

組 別 濃度/(μg/mL)A 值24 h 48 h DMEM組0.167±0.005 0.073±0.011 OPC組 40 0.582±0.0263 0.408±0.0193 CAS組 5 0.174±0.0121 0.090±0.0131 10 0.195±0.0162 0.086±0.0102 20 0.195±0.0271 0.088±0.0102 40 0.177±0.0191 0.087±0.0102 80 0.175±0.0221 0.087±0.0141

表5 CAS對小鼠B細(xì)胞體外增殖的影響(n=3，±s)Tab.5 Effect of CAS on mouse spleen cells proliferation(n=3，±s)

表5 CAS對小鼠B細(xì)胞體外增殖的影響(n=3，±s)Tab.5 Effect of CAS on mouse spleen cells proliferation(n=3，±s)

與對照組比較:1P＜0.05，2P＜0.01，3P＜0.001Compared with DMEM group:1P ＜0.05，2P ＜0.01，3P＜0.001

組 別 濃度/(μg/mL)A 值24 h 48 h DMEM組0.315±0.085 0.363±0.025 OPC組 40 0.737±0.0633 0.685±0.0503 CAS組 10 0.358±0.0901 0.454±0.0533 20 0.382±0.1111 0.503±0.0303 40 0.400±0.1142 0.567±0.0433 80 0.395±0.1282 0.679±0.0533 160 0.318±0.177 0.617±0.0483

圖3 DNA凝膠電泳Fig.3 Map of DNA agarose gel electrophoresis

4 討論

CAS經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳后，出現(xiàn)6條帶，而后三條帶著色深且?guī)挘f明在板栗蛋白溶液中該類蛋白的含量占絕大部分，是發(fā)揮作用的主要蛋白質(zhì)，之后的結(jié)構(gòu)分析證明，這三條帶均為同一種蛋白質(zhì)，這可能是由于電泳時(shí)使用β-巰基乙醇加熱處理樣品而造成亞基斷裂使蛋白處于還原狀態(tài)所致。

體外實(shí)驗(yàn)表明，板栗蛋白對腎臟細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用，其是否預(yù)示該蛋白對體內(nèi)腎臟器官也能起到保護(hù)作用，其體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

CAS對HepS，S180的增殖有顯著的抑制作用。DNA凝膠電泳的結(jié)果表明，CAS抑制HepS細(xì)胞增殖的機(jī)制可能是，在低濃度時(shí)引起細(xì)胞凋亡，高濃度時(shí)直接產(chǎn)生細(xì)胞毒作用造成細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)說明CAS在體外具有顯著的抗腫瘤活性，其可能機(jī)制是通過引起細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生作用。

CAS對免疫細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用，這一結(jié)果是否也預(yù)告我們，該蛋白在體內(nèi)具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，還有待我們下一步實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)只是初步研究，需要進(jìn)一步探究CAS抗腫瘤的作用靶點(diǎn)，以及是否對免疫器官也發(fā)揮作用，為合理、深入開發(fā)利用板栗蛋白提供科學(xué)依據(jù)。

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