劉萬順，成慧中，韓寶芹，畢慶慶，董 文，關(guān) 馳

（中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島266003）

單環(huán)刺螠纖溶酶UFEⅠ藥效作用和免疫原性的初步研究＊

劉萬順，成慧中，韓寶芹，畢慶慶，董 文，關(guān) 馳

（中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島266003）

為評價(jià)單環(huán)刺螠纖溶酶（UFEⅠ）的抗凝血和抗血栓形成作用，并對其免疫原性進(jìn)行初步研究。文中通過小鼠血液凝固時(shí)間實(shí)驗(yàn)和大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型研究UFEⅠ抗凝血和抗血栓作用。用純UFEⅠ為抗原免疫小鼠，間接ELISA法測定特異性抗體的動(dòng)態(tài)變化及效價(jià)。結(jié)果UFEⅠ能明顯延長小鼠凝血時(shí)間，有效抑制大鼠體內(nèi)的血栓形成，并顯著降低大鼠纖維蛋白原含量（FIB），延長活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）。免疫原性的研究結(jié)果為UFEⅠ末次免疫小鼠后，產(chǎn)生微量特異性抗體，且抗體水平呈現(xiàn)先升后降的動(dòng)態(tài)變化；方陣法確定了ELISA的優(yōu)化條件，測定UFEⅠ免疫后產(chǎn)生的抗體效價(jià)為1：1 280。本文研究顯示，單環(huán)刺螠纖溶酶UFEⅠ具有顯著的抗凝血和抗血栓形成作用，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生一過性抗體，但對動(dòng)物機(jī)體不造成負(fù)面影響。

單環(huán)刺螠；纖溶酶；抗凝血作用；抗血栓作用；免疫原性

血栓栓塞性疾病如腦血栓、冠心病、血栓栓塞性脈管炎及深部血栓性靜脈炎對人類健康危害極大。鏈激酶、尿激酶及組織型纖溶酶原激活物（t－PA）的問世使這類疾病得以治療，但新的溶栓、抗栓藥物的發(fā)現(xiàn)與研究仍是重要的醫(yī)藥學(xué)課題［1－4］。鑒于海洋生物活性物質(zhì)自身獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如抗腫瘤、溶解血栓、抗菌等作用，海洋生物逐漸成為新藥研發(fā)的珍貴資源［5－6］。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過多年對海洋無脊椎動(dòng)物單環(huán)刺螠的探索研究，從其體內(nèi)得到一種分子量為26kDa的纖溶酶，并對其溶栓活性進(jìn)行了初步研究，報(bào)道了該酶溶栓效果優(yōu)于蚓激酶，且具有直接降解血栓纖維蛋白的能力［7－8］。本文將對分離純化得到的新組分UFEⅠ（45kDa）進(jìn)行研究，初步評價(jià)其藥效學(xué)作用及免疫原性，進(jìn)一步豐富對單環(huán)刺螠體內(nèi)活性物質(zhì)的相關(guān)認(rèn)識。

1 材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

SPF級小鼠，購自青島市藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；雄性Wistar大鼠購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院；單環(huán)刺螠纖溶酶UFEⅠ凍干制劑（45kDa），本實(shí)驗(yàn)室制備；注射用尿激酶（Urokinase，25萬單位），國藥準(zhǔn)字H21023278，遼寧天龍藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（Bovine Albumin，BAS），北京拜爾迪生物公司產(chǎn)品；羊抗小鼠IgG－HRP，博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑（Freund’s complete adju－vant，F(xiàn)CA）和弗氏不完全佐劑（Freund’s incomplete adjuvant，F(xiàn)IA）均為Sigma公司分裝產(chǎn)品；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 主要儀器

TU－1800紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品；Mikro 22R離心機(jī)，德國赫提馳（Hettich）公司產(chǎn)品；BT87－2型體內(nèi)血栓形成測定儀，包頭醫(yī)學(xué)院心血管研究室產(chǎn)品；Rayto 2100C酶標(biāo)儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 抗凝血及抗血栓作用研究

2.1.1 小鼠血液凝固時(shí)間實(shí)驗(yàn)［9］30只小鼠（體重18～20g），雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組6只，設(shè)置陰性對照組（生理鹽水），UFEⅠ低、中、高劑量組（8.4、16.8及33.6mg／kg），陽性對照組（尿激酶5 000 U／kg）。均由尾靜脈注射給藥，給藥量為20mL／kg，給藥10min后摘取小鼠眼球，分別用玻片和毛細(xì)管取血。玻片法以用干燥針頭挑動(dòng)血滴后出現(xiàn)絲狀為凝血，毛細(xì)管法以折斷毛細(xì)管后出現(xiàn)絲狀為凝血。每15s觀察1次，計(jì)算取血到出現(xiàn)凝血絲時(shí)間為全血凝血時(shí)間，記錄各組凝血時(shí)間。實(shí)驗(yàn)組各劑量UFEⅠ的酶活力單位均采用纖維蛋白平板法，按照尿激酶活力單位標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定。

2.1.2 大鼠動(dòng)脈血栓形成實(shí)驗(yàn)［10］30只雄性Wistar大鼠（體重250～300g），隨機(jī)分為5組，每組6只。設(shè)置陰性對照組（生理鹽水），UFEⅠ低、中、高劑量組（5.8、11.6及23.2mg／kg），陽性對照組（尿激酶3500 U／kg），均由大鼠股靜脈給藥，給藥量為0.5mL／100g。腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1mL／kg）麻醉大鼠，剝離股靜脈給藥后，切開大鼠頸部皮膚，分離右側(cè)頸動(dòng)脈約15mm，將體內(nèi)血栓測定儀的刺激電極及連接儀器的溫度探頭鉤于動(dòng)脈上，于給藥后15min，打開儀器開關(guān)，通過刺激電極給予1.5mA電壓刺激，以損傷動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。隨著動(dòng)脈管腔內(nèi)血栓逐漸形成，血流逐漸被阻斷，則血管遠(yuǎn)端溫度突降，監(jiān)測血管表面溫度變化，記錄從刺激開始到溫度突降所需時(shí)間，為血栓形成時(shí)間。另于給藥后30min，腹主靜脈取血2.7mL，加0.3mL檸檬酸鈉（3.8%）抗凝，混勻后，檢測PT－凝血酶原時(shí)間，APTT－活化部分凝血活酶時(shí)間，TT－凝血酶時(shí)間，F(xiàn)IB－纖維蛋白原含量。實(shí)驗(yàn)組各劑量UFEⅠ的酶活力單位均采用纖維蛋白平板法，按照尿激酶活力單位標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定。

2.2 UFEⅠ免疫原性實(shí)驗(yàn)［11］

將30只小鼠隨機(jī)分為陰性對照組（生理鹽水，NS）、陽性對照組（牛血清白蛋白，BSA）和實(shí)驗(yàn)組（單環(huán)刺螠纖溶酶，UFEⅠ），每組10只。各組待測樣品溶液與等體積的弗氏完全佐劑（FCA）充分混合，經(jīng)皮下免疫小鼠。1周后，同量的待測樣品溶液與等體積的弗氏不完全佐劑（FIA）混合，經(jīng)皮下加強(qiáng)免疫小鼠，每隔1周加強(qiáng)免疫1次，總共加強(qiáng)免疫2次，觀察各組小鼠生長狀況。從初次免疫開始，第7、14、21、28天小鼠尾采血，并于第35天摘眼球取血，分離血清，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1 血清抗體檢測 從第1次免疫開始，每次免疫后1周，以及末次免疫后1周、2周和3周，即初次免疫后的第7、14、21、28和35天采血，分離血清，采用間接ELISA法測定小鼠體內(nèi)抗體動(dòng)態(tài)變化水平。

2.2.2 間接ELISA條件的建立 采用方陣法，將純UFEⅠ做1、2、3……9、10μg／mL的稀釋，包被酶標(biāo)板，抗血清分別稀釋10、20、40、80、160、320、640、1 280、2 560倍，進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，選擇最佳抗血清稀釋度和抗原包被量，并分別對包被條件、底物終止時(shí)間、抗血清、酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間、終止液濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.3 UFEⅠ抗體效價(jià)測定 用已優(yōu)化的ELISA條件，對抗血清進(jìn)行OD450值的測定，確定血清中UFEⅠ的抗體效價(jià)。

將抗體效價(jià)定義為：免疫組和陰性對照組OD450比值（P／N值）≥2.0所對應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)［12］。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 抗凝血及抗血栓作用研究

3.1.1 小鼠血液凝固時(shí)間實(shí)驗(yàn) 由表1可見，UFEⅠ低、中、高劑量組3個(gè)劑量均能明顯延長小鼠血液凝固時(shí)間，與生理鹽水組比較有顯著性差異（p＜0.05），且隨著UFEⅠ劑量的增加，血液凝固時(shí)間延長，表明該酶在小鼠體內(nèi)具有抗凝血作用。UFEⅠ中劑量組（玻片法／毛細(xì)管法）與尿激酶組比較均無顯著性差異（p＞0.05），說明相同酶活力單位（5 000U）的UFEⅠ和尿激酶的抗凝血作用效果相當(dāng)。

表1 單環(huán)刺螠纖溶酶UFEⅠ對小鼠血液凝固時(shí)間的影響Table 1 Effect of UFEⅠon coagulation time in mice（珚x±s，n＝6）

3.1.2 大鼠體內(nèi)血栓形成實(shí)驗(yàn) 與生理鹽水組比較，UFEⅠ低、中、高3個(gè)劑量組均能明顯延長大鼠體內(nèi)血栓形成時(shí)間（p＜0.05），且隨著UFEⅠ劑量的增加，血栓形成時(shí)間逐漸延長，表明該酶在大鼠體內(nèi)具有抗血栓形成的作用。與尿激酶組比較，UFEⅠ高劑量組無顯著性差異（p＞0.05），表明高劑量UFEⅠ（7 000 U）與尿激酶（3 500U）的抗血栓形成作用相當(dāng)（見表2）。單環(huán)刺螠纖溶酶UFEⅠ對血凝相關(guān)生化指標(biāo)的影響見表3。尿激酶組、UFEⅠ中、高劑量組分別與生理鹽水組相比，均使FIB極顯著降低（p＜0.01），尿激酶組與UFEⅠ組中、高劑量組比較無顯著性差異（p＞0.05），表明此劑量UFEⅠ與尿激酶對降低纖維蛋白原含量作用相當(dāng)。UFEⅠ組低、中、高3個(gè)劑量組可顯著延長APTT（p＜0.05，p＜0.01），但對TT和PT無顯著影響；APTT是反映凝血第一階段內(nèi)源性途徑的指標(biāo)，因此初步判斷UFEⅠ可作用于內(nèi)源性凝血途徑。綜上，UFEⅠ可以降低纖維蛋白原含量（FIB），并延長部分凝血活酶時(shí)間（APTT），依此可對該酶的具體抗凝血機(jī)理做進(jìn)一步研究。

表2 單環(huán)刺螠纖溶酶UFEⅠ對大鼠體內(nèi)成栓時(shí)間的作用Table 2 Effect of UFEⅠon time for thrombus formation in rats（珚x±s，n＝6）

表3 單環(huán)刺螠纖溶酶UFEⅠ在大鼠血栓模型中對APTT，F(xiàn)IB，PT和TT的影響Table 3 Effect of UFEⅠon PT，APTT，F(xiàn)IB and TT in carotid thrombosis test of rats（珚x±s，n＝6）

圖1 免疫后各組小白鼠的抗體含量變化曲線Fig.1 Variation curves of antibody content in different groups post－immunization

3.2 UFEⅠ免疫原性實(shí)驗(yàn)

3.2.1 小鼠體內(nèi)特異性抗體的動(dòng)態(tài)變化 以純UFEⅠ溶液包被酶標(biāo)板，檢測免疫后血清樣品的特異性抗體含量。以采血時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)組小鼠在末次免疫后1周（即第21天）采血分離血清，間接ELISA法檢測到產(chǎn)生了微量的特異性抗體，第28天檢測到特異性抗體水平達(dá)到最大，隨后在第35天出現(xiàn)下降趨勢?？贵w水平呈現(xiàn)先上升后下降的動(dòng)態(tài)變化。而陽性對照組（BSA）免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體于末次免疫后7d明顯提高，且抗體水平一直呈現(xiàn)上升趨勢，第35天檢測到OD450達(dá)到最大值。提示應(yīng)用UFEⅠ免疫后可能刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生一過性抗體。

3.2.2 間接ELISA條件的選擇 方陣結(jié)果顯示，當(dāng)抗血清做1∶10稀釋，抗原包被濃度為2μg／mL時(shí)，所測定的OD450值接近1.0，且P／N最大，非特異性較低。據(jù)此，確定抗血清的工作濃度為1∶10，抗原最佳包被濃度為2μg／mL。其他優(yōu)化條件為用含1%BSA的PBS（pH＝7.4，0.15mol／L），37℃封閉1h；待檢血清用PBS稀釋，37℃作用45min；酶標(biāo)二抗按1∶5 000稀釋，作用45min，底物終止反應(yīng)進(jìn)行15min時(shí)，用濃度為2mol／L的H2SO4溶液終止顯色。

3.2.3 抗體效價(jià)的測定 根據(jù)已初步建立的ELISA條件，進(jìn)行抗體效價(jià)的測定。在末次免疫后，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了特異性抗體，并于末次免疫后1、2、3周出現(xiàn)先上升后下降的動(dòng)態(tài)變化，根據(jù)免疫組與陰性對照組比值（P／N值）≥2.0所對應(yīng)的最大稀釋度為待測樣品的效價(jià)，測得UFEⅠ免疫產(chǎn)生的抗體效價(jià)為1∶1 280（見表4）。

表4 纖溶酶UFEⅠ抗體效價(jià)的測定Table 4 Determination of antibody titers of UFEⅠ

3.2.4 免疫小鼠的生長狀況 免疫期以及免疫后期的觀察中，各組小鼠體重增長情況基本一致，但陽性組14d后體重有減緩增長趨勢，并于免疫后期基本保持不變。對免疫后期各組小鼠體重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，飼養(yǎng)末期實(shí)驗(yàn)組小鼠體重與陰性對照組比較無顯著性差異（p＞0.05），生長狀況一致，證明體內(nèi)注射UFEⅠ對小鼠生長狀況無不良影響（見圖2）。

圖2 各組小鼠體重的變化曲線Fig.2 Variation curves of body weight of mice in different groups

4 討論

單環(huán)刺螠纖溶酶（UFEⅠ）對小鼠體內(nèi)凝血時(shí)間的影響表明，該酶具有延長小鼠體內(nèi)凝血時(shí)間的作用，且隨劑量增加作用增強(qiáng)。應(yīng)用大鼠頸動(dòng)脈血栓模型研究該酶對血栓形成時(shí)間的影響，顯示其具有顯著延長大鼠體內(nèi)血栓形成時(shí)間的作用。本文作者觀察了給藥后對大鼠PT、APTT、FIB和TT的影響，結(jié)果表明不同劑量的UFEⅠ均能降低血漿中FIB的含量，并可延長APTT，但對PT和TT無顯著影響。在凝血系統(tǒng)的作用機(jī)制中，纖維蛋白原在凝血酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，直接參與凝血過程，還可介導(dǎo)血小板的聚集反應(yīng)［13］，APTT可反映凝血第一階段內(nèi)源性凝血途徑的狀態(tài)。單環(huán)刺螠纖溶酶UFEⅠ對凝血因子的作用結(jié)果表明，其可能通過影響內(nèi)源性凝血途徑和血小板的聚集，以及其較強(qiáng)的纖溶活力發(fā)揮抗凝作用，抑制血栓的形成，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

藥物的免疫原性是指藥物刺激機(jī)體形成特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞的性質(zhì)。隨著大量生物技術(shù)藥物的研發(fā)，免疫原性的評價(jià)成為闡明這些藥物臨床安全性和有效性的關(guān)鍵因素［14］。初金鑫等［15］研究顯示，單環(huán)刺螠纖溶酶UFEⅠ無溶血毒性，靜脈注射安全性較高。作為一種潛在溶栓藥物，有必要對其進(jìn)行免疫原性研究。本文采用皮下多點(diǎn)多次注射免疫小鼠，間接ELISA法檢測特異性抗體產(chǎn)生水平，結(jié)果表明末次免疫后1周開始出現(xiàn)特異性抗體，但水平較低，僅在血清稀釋度為1∶10時(shí)出現(xiàn)陽性數(shù)值。末次免疫后第2周抗體水平有所提高，3周后下降，呈現(xiàn)先升高后下降的動(dòng)態(tài)變化趨勢，表現(xiàn)出一過性。根據(jù)免疫組與陰性對照組比值（P／N值）≥2.0所對應(yīng)的最大稀釋度為待測樣品的效價(jià)，測得UFEⅠ（45kDa）免疫產(chǎn)生的抗體效價(jià)為1∶1 280，且與陰性對照組比較具有顯著差異（P＜0.05），說明單環(huán)刺螠纖溶酶（UFEⅠ）可以使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生微量的特異性抗體，能刺激動(dòng)物體內(nèi)啟動(dòng)體液免疫，提高機(jī)體的整體免疫水平。與此同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)組小鼠未出現(xiàn)異常反應(yīng)，與陰性對照組小鼠的體重增長狀況基本一致，說明單環(huán)刺螠纖溶酶（UFEⅠ）不屬于毒素蛋白，對動(dòng)物機(jī)能不造成負(fù)面影響。本研

究雖不能完全預(yù)測單環(huán)刺螠纖溶酶（UFEⅠ）對人的免疫原性反應(yīng)，但對于其免疫毒性的研究可作為參考和提示。其他方面有待進(jìn)一步精確深入的研究，以明確其對安全性評價(jià)的影響以及抗藥物抗體對藥物的活性，藥物的清除等方面的影響。

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Pharmacologic Effects and Immunogenicity of Fibrinolytic Enzyme UFEⅠfrom Urechis unicinctus

LIU Wan－Shun，CHENG Hui－Zhong，HAN Bao－Qin，BI Qing－Qing，DONG Wen，GUAN Chi
（College of Marine Life Sciences，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

To study the anticoagulability and antithrombotic activity，and to evaluate the immunogenicity of fibrinolytic enzyme UFEⅠfromUrechis unicinctus，preliminary，the effects of anticoagulability and antithrombotic activity were observed by the the experiments of thrombolysin on coagulation time in mice and carotid thrombosis in rats respectively.The dynamic changes of IgG and the antibody titers were detected by ELISA method after immunizing the mice with UFEⅠ.The results inchicated that UFEⅠsignificantly prolonged the coagulation time in mice，and effectively inhibited thrombosis of rats in vivo.Moreover，the fibrinogen content（FIB）was decreased，whereas the activated partial thromboplastin time（APTT）was prolonged.In case of the injury experiment in mice，the specific antibody appeared after one week，which dynamic tendency of initial rising and later dropping.The specific antibody titer was to be 1：1280by the optimal ELISA method.Conclusion was achieved that UFEⅠpossesses significant effects on anticoagulability and antithrombotic activity，which induces a temporary rise of specific antibodies in mice，but does not affect adversely on animal bodies.

Urechis unicinctus；fibrinolytic enzyme；anticoagulability；antithrombotic activity；immunogenicity

Q178.53；Q599

A

1672－5174（2012）1－2－088－05

國家“十一五”重大專項(xiàng)（2009ZX09103－646）資助

2011－03－02；

2011－03－20

劉萬順（1950－），男，教授。E－mail：WanshunLiu＠hotmail.com

責(zé)任編輯 朱寶象