樊廷俊，荊 昭，樊現(xiàn)遠(yuǎn)

（中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島266003）

海洋無(wú)脊椎動(dòng)物酚氧化酶的研究進(jìn)展＊

樊廷俊，荊 昭，樊現(xiàn)遠(yuǎn)

（中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島266003）

海洋無(wú)脊椎動(dòng)物缺乏真正意義上的抗體，沒(méi)有免疫記憶，只能靠非特異性免疫系統(tǒng)防御和抵抗病原體的感染。酚氧化酶原激活系統(tǒng)是海洋無(wú)脊椎動(dòng)物非特異性免疫系統(tǒng)中至關(guān)重要的一員，而酚氧化酶作為該系統(tǒng)末端的一種含銅金屬酶，則通過(guò)催化黑化反應(yīng)在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物非特異性免疫防御中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。本文結(jié)合作者已有的研究成果并綜合本領(lǐng)域的大量參考文獻(xiàn)對(duì)酚氧化酶原激活系統(tǒng)和酚氧化酶的免疫學(xué)功能、激活機(jī)制、生化性質(zhì)與酶性質(zhì)以及基因與分子結(jié)構(gòu)等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

酚氧化酶；酚氧化酶原激活系統(tǒng)；海洋無(wú)脊椎動(dòng)物

隨著海洋無(wú)脊椎動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的提高，各種疾病的發(fā)生日益頻繁，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為限制海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素之一［1］。為了避免或減少疾病給海水養(yǎng)殖業(yè)造成的不利影響，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注并研究海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)。

海洋無(wú)脊椎動(dòng)物具有開(kāi)放式循環(huán)系統(tǒng)，體液中沒(méi)有T細(xì)胞及免疫球蛋白，因而不具備脊椎動(dòng)物復(fù)雜的特異性免疫系統(tǒng)。大部分海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的體表具有堅(jiān)硬的鈣質(zhì)或幾丁質(zhì)外殼作為抵御外界入侵的物理屏障。但海洋中存在的大量病原體仍然可以通過(guò)一些途徑，例如創(chuàng)傷和攝食等，突破這道物理屏障。在漫長(zhǎng)的與病原體的斗爭(zhēng)中，海洋無(wú)脊椎動(dòng)物發(fā)展了一套不同于脊椎動(dòng)物的，以血細(xì)胞和體液因子為基礎(chǔ)的非特異性免疫系統(tǒng)來(lái)防御和抵抗外界病原體的侵襲［2－3］，其中，酚氧化酶（phenoloxidase，PO）與酚氧化酶原激活系統(tǒng)（prophenoloxidase－activating system，proPOAS）發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［4］，因而受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。本文結(jié)合作者已有的研究成果并綜合本領(lǐng)域的大量參考文獻(xiàn)對(duì)PO和proPO－AS的免疫學(xué)功能、激活機(jī)制、生化性質(zhì)與酶性質(zhì)以及基因與分子結(jié)構(gòu)等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 酚氧化酶與酚氧化酶原激活系統(tǒng)

1.1 酚氧化酶與酚氧化酶原激活系統(tǒng)的功能

酚氧化酶（PO）是一類含銅的氧化酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)。1917年，Bloch發(fā)現(xiàn)L－3，4－二羥苯丙氨酸（L－DOPA）可作為體外人體皮膚黑色素細(xì)胞中黑色素形成的底物，此后，學(xué)者們均以該底物作為PO研究的特異性底物。由于研究的物種、方法與標(biāo)準(zhǔn)不同，長(zhǎng)期以來(lái)，不同文獻(xiàn)對(duì)于PO的命名也不盡相同，如酪氨酸酶（tyrosinase）、單酚氧化酶（monophenoloxidase）和PO，3個(gè)名稱卻對(duì)應(yīng)于同一個(gè)酶學(xué)編碼（E.C.1.14.18.1），為了消除這種命名的混亂，Sugumaran［5］于1996年根據(jù)信號(hào)肽和跨膜域序列的分子結(jié)構(gòu)差異將酪氨酸酶專用于哺乳動(dòng)物、PO專用于無(wú)脊椎動(dòng)物，因?yàn)闊o(wú)脊椎動(dòng)物PO沒(méi)有信號(hào)肽和跨膜域序列。目前，該命名方法已被學(xué)術(shù)界普遍接受［6］。

在脊椎動(dòng)物中，PO主要參與皮膚色素和其它多酚化合物的形成［7］；而在無(wú)脊椎動(dòng)物中，PO不僅參與黑色素形成，還參與角質(zhì)硬化、傷口愈合［8］以及宿主的非特異性免疫防御反應(yīng)［9－12］；在頭足類軟體動(dòng)物中，PO還參與墨汁中黑色素和表皮細(xì)胞色素的形成［13］。

大量研究顯示，無(wú)脊椎動(dòng)物的PO在正常情況下是以無(wú)活性的前體——酚氧化酶原（prophenoloxidase，proPO）的形式存在的［2－3，5－6，9－11］，proPO－AS是一種與脊椎動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)相類似的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，正常情況下，該系統(tǒng)以非活化狀態(tài)存在于無(wú)脊椎動(dòng)物血細(xì)胞的顆粒中，當(dāng)病原體入侵時(shí)，該系統(tǒng)將被激活并最終導(dǎo)致黑化反應(yīng)而將病原體清除。病原體表面特有的結(jié)構(gòu)成分如革蘭氏陰性菌中的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、革蘭氏陽(yáng)性菌中的肽聚糖（peptidoglycan）以及真菌中的β－1，3－葡聚糖（β－1，3－glucan）等被稱為病原相關(guān)分子模式（pathogen－associated molecularpatterns，PAMPs），其可被宿主的模式識(shí)別蛋白特異性的結(jié)合，模式識(shí)別蛋白一旦與這些外來(lái)物質(zhì)結(jié)合便可激活酚氧化酶原激活酶原（pro－PPAE）轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘姆友趸冈せ蠲福╬rophenoloxidase－activating enzyme，PPAE），并通過(guò)限制性蛋白水解作用使proPO裂解，從而釋放一個(gè)小肽而轉(zhuǎn)變成有活性的PO。激活后的PO可以將酚類底物氧化成醌，醌經(jīng)一系列非酶促反應(yīng)生成最終產(chǎn)物——黑色素（melanin）［9－11，13－14］，這種黑色素對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)是具有毒性的，同時(shí)黑色素形成過(guò)程中還伴隨有具細(xì)胞毒性的半醌、三羥酚和活性氧生成，半醌具有結(jié)合親核物質(zhì)的特性，能結(jié)合到病原體細(xì)胞的表面，通過(guò)形成黑色素包囊來(lái)隔離并殺滅入侵的病原體；而活性氧，如超氧陰離子、羥基自由基和過(guò)氧化氫一直被認(rèn)為是脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物免疫防御系統(tǒng)的細(xì)胞毒性成分［15－16］，其極強(qiáng)的氧化性能夠?qū)Σ≡w進(jìn)行有效的殺傷。

1.2 酚氧化酶原激活系統(tǒng)的組成

無(wú)脊椎動(dòng)物的proPO－AS包括了模式識(shí)別蛋白，酚氧化酶原激活酶和酚氧化酶原抑制劑等多種成分，它們協(xié)同作用，共同構(gòu)成了這個(gè)復(fù)雜的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)。

1.2.1 模式識(shí)別蛋白（pattern－recognition proteins）

模式識(shí)別蛋白能夠識(shí)別并結(jié)合病原體特有的病原相關(guān)分子模式（PAMPs），如革蘭氏陰性菌中的LPS、革蘭氏陽(yáng)性菌中的肽聚糖和真菌中的β－1，3－葡聚糖，并進(jìn)而激活pro－PPAE轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘腜PAE，通過(guò)限制性蛋白水解作用激活proPO轉(zhuǎn)變成有活性的PO。

目前已知的模式識(shí)別蛋白主要有脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide－binding protein，LBP）、肽聚糖結(jié)合蛋白（peptidoglycan－binding protein，PGBP）和β－葡聚糖結(jié)合蛋白（β－1，3－glucan－binding protein，BGBP）3類。LBP已在馬蹄蟹（Limulus polyphemus）等海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)［17］，它能與LPS結(jié)合并激活pro－PO－AS，從不同物種中得到的LBP的分子量、結(jié)構(gòu)以及生化特性有很大的差異，至今仍未發(fā)現(xiàn)其共有結(jié)構(gòu)；PGBP是在家蠶（Bombyx mori）中被首次發(fā)現(xiàn)的［18］，后來(lái)在斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）等甲殼動(dòng)物中也有發(fā)現(xiàn)［19－20］，它能與肽聚糖結(jié)合并激活proPO－AS以及其它多種免疫反應(yīng)；BGBP最早也是在家蠶（B.mori）中被發(fā)現(xiàn)的［21］，能夠結(jié)合葡聚糖并激活proPOAS，還可引發(fā)血細(xì)胞的脫顆粒及調(diào)理作用［20］，此后在斑節(jié)對(duì)蝦（P.monodon）［22］、加州對(duì)蝦（Penaeus californiensis）［23］、凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）［24］、南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）和紅額角對(duì)蝦（Penaeus stylirostris）中也有發(fā)現(xiàn)，其為單體蛋白，分子量約為100kDa，氨基酸組成和N－末端序列比較保守［25］，另外在馬蹄蟹（L.polyphemus）中也發(fā)現(xiàn)了BGBP，其為雙亞基蛋白，大亞基包含葡聚糖酶結(jié)構(gòu)域，小亞基包含絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域［26］，其結(jié)構(gòu)與氨基酸序列對(duì)比上述幾種甲殼類BGBP具有明顯的不同。

1.2.2 酚氧化酶原激活酶（prophenoloxidase－activating enzyme，PPAE） PPAE最早是在淡水鰲蝦（Pacifastacus leniusculus）中被發(fā)現(xiàn)的［27］，后來(lái)在海產(chǎn)的藍(lán)蟹（Callinectes sapidus）等物種中也有發(fā)現(xiàn)［28］，該酶是一種絲氨酸蛋白酶，分子量約為36kDa，其C－端有一個(gè)典型的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，而N－端有一個(gè)或多個(gè)回形結(jié)構(gòu)域，其功能可能與絲氨酸蛋白酶活性的激活有關(guān)，還可能與抗菌肽的功能有關(guān)［28－29］。

最近有研究者從斑節(jié)對(duì)蝦（P.monodon）血細(xì)胞中得到了2種PPAE（PmPPAE1和PmPPAE2）［30］，它們具有絲氨酸蛋白酶家族典型的回形結(jié)構(gòu)域，與已獲得的節(jié)肢動(dòng)物PPAE氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果證明其是一類新的甲殼動(dòng)物PPAE；轉(zhuǎn)錄分析顯示PmPPAE2主要在血細(xì)胞中表達(dá)，通過(guò)RNAi方法抑制PmPPAE2導(dǎo)致對(duì)蝦血淋巴中總PO活性的顯著減少（41%），同時(shí)更易感染哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）；基因組分析表明PmPPAE1和PmPPAE2是由不同的基因座編碼的，PmPPAE1基因由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成，PmPPAE2由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成；對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦proPO－AS的4個(gè)關(guān)鍵基因（PmPPAE1，PmPPAE2，PmproPO1，PmproPO2）在幼蟲(chóng)發(fā)育階段的表達(dá)分析表明：PmPPAE1和PmproPO2在全部的幼蟲(chóng)階段（無(wú)節(jié)幼蟲(chóng)、前水蚤幼蟲(chóng)、糠蝦狀幼蟲(chóng)和仔蝦）都有表達(dá)，而PmPPAE2和PmproPO1主要在幼蟲(chóng)發(fā)育的晚期表達(dá)（糠蝦狀幼蟲(chóng)和仔蝦）［30］，表明PmPPAE2在蝦中發(fā)揮了PPAE的功能，而且很可能介導(dǎo)了Pmpro－PO1的激活。

1.2.3 酚氧化酶原抑制劑（prophenoloxidase inhibitor）

由于proPO－AS所產(chǎn)生的醌和黑色素對(duì)宿主自身也具有毒性，因而該系統(tǒng)的活性必須受到嚴(yán)格的調(diào)控。目前，對(duì)proPO抑制劑的研究成果主要來(lái)自于果蠅和淡水螯蝦，而海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的則較少，已研究的pro－PO抑制劑主要有2類：枯草桿菌蛋白酶抑制劑和α－巨球蛋白。前者為單體，分子量約為23kDa，等電點(diǎn)（pI）約為4.7，具較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性（可耐80℃高溫）和酸堿耐受性（pH＝1.0～11.5）［31］；后者多為二聚體，每個(gè)亞基的分子量約為190kDa，可部分抑制PPAE的活性，與脊椎動(dòng)物的補(bǔ)體蛋白C3和C4具有較高的序列相似性［32］。這些抑制劑可調(diào)控proPO－AS的活性以避免其自發(fā)或過(guò)度激活，從而保護(hù)宿主自身免受其毒害。

2 酚氧化酶的生化性質(zhì)與酶性質(zhì)

PO在無(wú)脊椎動(dòng)物中廣泛存在，現(xiàn)已從許多物種中分離純化出PO或proPO，并對(duì)其生化性質(zhì)與酶性質(zhì)進(jìn)行了研究。依據(jù)來(lái)源物種的不同，各種PO的分子大小、等電點(diǎn)等生化性質(zhì)以及最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH值、底物親和力和抑制劑等酶性質(zhì)也相應(yīng)的存在一定差異。如日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus）PO對(duì)LDOPA底物的最適反應(yīng)溫度和pH值分別為40℃和7.0，當(dāng)溫度高于50℃時(shí)迅速失活，該酶對(duì)三元酚（焦性沒(méi)食子酸）和二元酚（兒茶酚、L－DOPA）具有較高的底物親和力，而對(duì)單酚（L－酪氨酸）的親和力很低，且其酶活性能被二硫蘇糖醇和半胱氨酸所強(qiáng)烈抑制［33］；而斑節(jié)對(duì)蝦（P.monodon）PO在37℃時(shí)具有最高酶活性，且LPS、β－葡聚糖、酵母聚糖和弧菌均能激活其PO活性，而胰蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制劑和苯甲脒等對(duì)其活性無(wú)影響［34］。

1999年，Gollás－Galvan等［35］對(duì)加州對(duì)蝦（P.californiensis）的研究結(jié)果顯示，其proPO為分子量114 kDa的單體蛋白，經(jīng)酶解后可產(chǎn)生一個(gè)分子量為107 kDa的PO，二者的等電點(diǎn)均為7.35，PO對(duì)L－DOPA底物的最適反應(yīng)pH值為8.0，其酶活性可被DETC、Cu2＋、疊氮鈉、硫脲和EDTA所有效抑制；孫兆峰等［36］對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）和凡納濱對(duì)蝦（L.vannamei）PO活性的研究顯示，其最適反應(yīng)溫度分別為50和45℃、最適反應(yīng)pH值分別為8.5和7.5，且均可為胰蛋白酶、SDS和酵母聚糖所激活；樊廷俊等［14］對(duì)中國(guó)對(duì)蝦（Penaeus chinensis）的研究顯示，其分子量為87.5kDa的proPO經(jīng)SDS激活后可產(chǎn)生分子量為77kDa的PO，該P(yáng)O對(duì)L－DOPA的最適反應(yīng)條件為40℃、pH＝6.0，Km值約為1.99mmol·L－1，且該P(yáng)O對(duì)酪氨酸等單酚也具有較強(qiáng)的底物親和力，綜合各種氧化酶抑制劑、金屬螯合劑和金屬離子對(duì)其活性的影響結(jié)果證實(shí)其為一種酪氨酸酶型的含銅金屬酶；Liu等［37］對(duì)日本蟳（Charybdis japonica）血淋巴中proPO和PO的研究結(jié)果顯示，其分子量分別為69.5和64.5kDa，PO在40℃、pH6.0時(shí)具有最高酶活性，其對(duì)底物L(fēng)－DOPA和兒茶酚的Km值分別為3.41和7.97mmol·L－1，綜合各種氧化酶抑制劑、金屬螯合劑和金屬離子的影響結(jié)果表明該P(yáng)O是一種兒茶酚酶型的含銅金屬酶；Giménez等［38］對(duì)挪威龍蝦（Nephrops norvegicus）的殼和內(nèi)臟中PO的研究結(jié)果顯示，2種來(lái)源的PO活性均隨溫度的升高而升高，直至60℃，其中提取自殼的PO具有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在65℃時(shí)仍保持有40%的酶活性，其對(duì)兒茶酚的Km值為19.40mmol·L－1，而從內(nèi)臟中得到的PO對(duì)兒茶酚的Km值為5.97mmol·L－1，顯示出更強(qiáng)的底物親和力。

Tetsushi等［39］對(duì)魷魚(yú)（Illex argentinus）PO的研究結(jié)果顯示，其分子量為140.2kDa，包含2個(gè)70.1 kDa的亞基，其最適pH值為8.0；Palumbo［13］研究了烏賊（Sepia officinalis）墨汁中的PO，結(jié)果顯示其分子量為125kDa，對(duì)底物L(fēng)－DOPA的最適反應(yīng)pH值為7.5，Km值為10mmol·L－1，而對(duì)L－酪氨酸的Km值為3.3mmol·L－1，可見(jiàn)其對(duì)L－酪氨酸具有更強(qiáng)的底物親和力；Fan等［40］從短蛸（Octopus ocellatus）墨囊中也分離純化出了PO，研究發(fā)現(xiàn)其為153.8kDa的異二聚體蛋白，亞基分子量分別為75.6和73.0kDa，其最適反應(yīng)條件為40℃、pH＝7.0，對(duì)底物L(fēng)－DOPA和兒茶酚的Km值分別為3.1和6.3mmol·L－1，同時(shí)綜合各種氧化酶抑制劑、金屬螯合劑和金屬離子對(duì)該酶活性的影響表明該P(yáng)O是一種兒茶酚酶型的含銅金屬酶。

孫虎山等［41］對(duì)櫛孔扇貝（Chamys farreri）血淋巴中PO的研究顯示，其最適pH值為6.0，當(dāng)pH升高或降低時(shí)，PO活性均迅速下降，當(dāng)pH達(dá)到7.5時(shí)已檢測(cè)不到PO活性，其最適反應(yīng)溫度為45℃，高于45℃時(shí)，該酶的活性迅速下降，而低于45℃時(shí)，該酶的活性下降則相對(duì)較慢；Cong等［42］對(duì)菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）的研究顯示，其proPO分子量為84.1 kDa，經(jīng)激活后可轉(zhuǎn)變?yōu)?6.9kDa的PO，該P(yáng)O的最適反應(yīng)條件為40℃、pH＝7.0，對(duì)底物L(fēng)－DOPA和酪氨酸的Km值分別為2.2和6.0mmol·L－1，同時(shí)綜合各種氧化酶抑制劑、金屬螯合劑和金屬離子的影響結(jié)果表明該P(yáng)O是一種酪氨酸酶類型的含銅金屬酶。

除上述研究較多的甲殼類、頭足類和雙殼貝類以外，F(xiàn)rizzo等［43］還研究了海鞘（Botryllus schlosseri）的PO，發(fā)現(xiàn)其為由2個(gè)亞基經(jīng)二硫鍵鏈接而成的同二聚體蛋白，每個(gè)亞基的分子量為80kDa，其對(duì)L－DOPA的最適反應(yīng)pH范圍為7.0～7.5，最適反應(yīng)溫度為35℃，Km值為4.62mmol·L－1。

3 酚氧化酶的基因與分子結(jié)構(gòu)

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和其他相關(guān)學(xué)科的快速發(fā)展，對(duì)PO的結(jié)構(gòu)及其激活的分子機(jī)制等研究均取得了很大進(jìn)展。目前的研究結(jié)果顯示，proPO或PO具有2個(gè)保守的功能性Cu2＋結(jié)合位點(diǎn)，CuA和CuB，2個(gè)Cu2＋分別結(jié)合了3個(gè)組氨酸。在CuB的結(jié)構(gòu)中，有2個(gè)組氨酸位于同1個(gè)α－螺旋上，而另1個(gè)組氨酸則單獨(dú)位于另1個(gè)α－螺旋上，該結(jié)構(gòu)在各物種中高度一致；而CuA的結(jié)構(gòu)則隨物種的不同而略有所差異，如節(jié)肢動(dòng)物中的CuA具有與CuB相同的結(jié)構(gòu)；而在軟體動(dòng)物中，CuA的2個(gè)組氨酸分別位于2個(gè)α－螺旋上，而另1個(gè)組氨酸則位于其中1個(gè)α－螺旋之后的回環(huán)結(jié)構(gòu)中。另外，目前已知的絕大部分無(wú)脊椎動(dòng)物的proPO結(jié)構(gòu)中都沒(méi)有信號(hào)肽［6－7，39，44－46］。

在proPO－AS中，proPO一般是由絲氨酸蛋白酶酶切而形成有活性的PO，其酶切位點(diǎn)因所在物種的不同也不盡相同，如節(jié)肢動(dòng)物proPO的酶切位點(diǎn)在其N－末端，而植物和真菌的proPO則在C－末端。在節(jié)肢動(dòng)物PO的結(jié)構(gòu)中，距離其活性位點(diǎn)約3～4處的Phe49位點(diǎn)非常保守，在其N－末端被切除后，原先占據(jù)活性位點(diǎn)的Phe49便被推出，在活性位點(diǎn)處形成一個(gè)大的口袋狀結(jié)構(gòu)，使底物能夠進(jìn)入。當(dāng)?shù)孜镞M(jìn)入活性位點(diǎn)后，其苯環(huán)與Cu－O2－Cu平面相垂直，通過(guò)羥基與CuA緊密結(jié)合，同時(shí)苯環(huán)的正位與2個(gè)氧原子中的一個(gè)相結(jié)合，催化底物的氧化［45，47］。

Sritunyalucksana等［45］從斑節(jié)對(duì)蝦（P.monodon）的cDNA文庫(kù)中也克隆到了proPO的序列，結(jié)果顯示其cDNA全長(zhǎng)為3 002bp，其中含有一個(gè)2 121bp的讀碼框。其推測(cè)分子量為79kDa，等電點(diǎn)為5.8，存在有2個(gè)高度保守的Cu2＋結(jié)合位點(diǎn)，無(wú)信號(hào)肽序列，該proPO激活的裂解位點(diǎn)位于Arg44和Val45之間；氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，該proPO與淡水鰲蝦的proPO非常相似，而與昆蟲(chóng)的proPO同源性較低。Lai等［46］從凡納濱對(duì)蝦（L.vannamei）的血細(xì)胞中獲得了編碼proPO的cDNA，其全長(zhǎng)為2 471bp，其中含有1個(gè)2 058bp的讀碼框，其推測(cè)分子量為78.1kDa，等電點(diǎn)為6.02，該proPO的結(jié)構(gòu)中包含1個(gè)保守的Cu2＋結(jié)合位點(diǎn)，1個(gè)蛋白質(zhì)裂解位點(diǎn)和1個(gè)保守的C－末端序列，與其他多數(shù)無(wú)脊椎動(dòng)物一樣，該proPO也沒(méi)有信號(hào)肽序列。另外值得一提的是，在海鞘（Halocynthia roretzi）中克隆到的proPO是具有信號(hào)肽和跨膜區(qū)的，其與脊椎動(dòng)物酪氨酸酶的相似性要高于其與其他無(wú)脊椎動(dòng)物proPO的相似性，這表明酪氨酸酶與proPO可能是由同一種Cu結(jié)合蛋白進(jìn)化而來(lái)的，它們均屬于酪氨酸酶家族［48］。

4 免疫促進(jìn)劑的應(yīng)用

各種疾病的頻繁發(fā)生是當(dāng)今困擾海洋無(wú)脊椎動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的1個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題，但目前對(duì)于病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)等疾病的預(yù)防和治療仍缺乏有效的措施，傳統(tǒng)的抗生素藥物也因?yàn)E用而失去應(yīng)有的效力，因此提高海水養(yǎng)殖無(wú)脊椎動(dòng)物的自身免疫力，是目前控制病害的有效途徑［49－51］。

免疫促進(jìn)劑是能夠促進(jìn)或誘發(fā)宿主免疫防御反應(yīng)、增強(qiáng)機(jī)體抗病能力的物質(zhì)［50－51］，主要作用于無(wú)脊椎動(dòng)物的非特異性免疫系統(tǒng)，通過(guò)激活機(jī)體自身的免疫機(jī)能，增強(qiáng)其抗病力。目前，海水養(yǎng)殖動(dòng)物免疫促進(jìn)劑主要包括：多糖、寡糖、多肽、病原體抗原、維生素以及化學(xué)合成藥物等類型［50－53］，其中多糖和病原體抗原是海水養(yǎng)殖業(yè)最常用的2類免疫促進(jìn)劑［52－56］。汪小峰等［51］和樊廷俊等［57］分別利用LPS、β－葡聚糖、滅活鰻弧菌（Vibrio anguillarum）和滅活哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）4種免疫促進(jìn)劑對(duì)中國(guó)對(duì)蝦（P.chinensis）和日本蟳（C.japonica）PO以及血細(xì)胞的研究結(jié)果顯示，經(jīng)4種免疫促進(jìn)劑處理后，2種動(dòng)物的PO產(chǎn)量和總酶活性均有顯著增加，但PO的比活性沒(méi)有顯著變化，并證實(shí)多糖類免疫促進(jìn)劑與滅活弧菌類免疫促進(jìn)劑對(duì)非特異性免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制不同：多糖類免疫促進(jìn)劑LPS和β－葡聚糖主要作用于大顆粒細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞，提高proPO激活組分的產(chǎn)量，進(jìn)而提高總PO活性；而滅活弧菌類免疫促進(jìn)劑主要提高透明細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞的吞噬活性，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。

Sung等［58－59］的研究表明，β－葡聚糖溶液浸泡的斑節(jié)對(duì)蝦（P.monodon）對(duì)弧菌（Vibrio vulnificans）的抗性提高，且經(jīng)熱致死弧菌處理后其PO活性顯著提高約13倍，也證實(shí)多糖和弧菌類免疫促進(jìn)劑可通過(guò)提高PO的活性進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)蝦的自身免疫力。李光友等［60］發(fā)現(xiàn)，濃度低于10μg／mL的LPS對(duì)中國(guó)對(duì)蝦（P.chinensis）血細(xì)胞吞噬活性有加強(qiáng)作用，而高于該值時(shí)反而會(huì)表現(xiàn)出一定毒性。李天道等［61］在研究中國(guó)對(duì)蝦（P.chinensis）時(shí)發(fā)現(xiàn)，小劑量弧菌（V.vulnificans）能誘導(dǎo)對(duì)蝦PO活性的升高，但當(dāng)弧菌密度超過(guò)水體中弧菌致病的臨界值（105CFU／mL）時(shí)卻對(duì)對(duì)蝦的免疫力造成負(fù)面影響。由此可見(jiàn)，免疫誘導(dǎo)的劑量的高低也影響著受試對(duì)象的免疫力，適量的誘導(dǎo)有助于提高動(dòng)物的自身免疫力，而當(dāng)誘導(dǎo)劑量過(guò)高反而會(huì)降低其自身免疫力。因此，利用免疫促進(jìn)劑誘導(dǎo)提高動(dòng)物自身免疫力時(shí)，不僅要確定能產(chǎn)生最大免疫力的有效誘導(dǎo)劑量，還需要結(jié)合不同種蝦、蟹的個(gè)體差異和實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境確定最適的實(shí)施條件。

5 研究展望

盡管越來(lái)越多的proPO－AS相關(guān)因子被純化與鑒定出來(lái)，但與之相關(guān)的具體激活機(jī)制及其在免疫過(guò)程中的具體作用等仍不清楚，PO的不同存在形式、存在部位以及激活條件等均尚未確定，顆粒細(xì)胞脫顆粒的誘導(dǎo)機(jī)制、proPO激活過(guò)程的受體和信號(hào)通路以及感染過(guò)程中細(xì)胞間的聯(lián)系等具體細(xì)節(jié)也均未查清此外，除PO激活過(guò)程中產(chǎn)生的醌和黑色素以外，人們對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的其它殺菌物質(zhì)還了解甚少，對(duì)病原菌抵抗宿主防御系統(tǒng)的策略等也不清楚，這些問(wèn)題均有待進(jìn)一步的研究。上述問(wèn)題的闡明將有助于人們更好的了解無(wú)脊椎動(dòng)物的非特異性免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制，同時(shí)為海水養(yǎng)殖病害的防御與治療提供理論依據(jù)，具有重要的理論與實(shí)踐意義。

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Research Advances on Phenoloxidase of Marine Invertebrates

FAN Ting－Jun，JING Zhao，F(xiàn)AN Xian－Yuan
（College of Marine Life Sciences，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Marine invertebrates lack the true meaning of the antibodies and immune memory and have to resist pathogen infection with non－specific immune system.Prophenoloxidase－activating system is one of the most important components of the non－specific immune system in marine invertebrates，but0phenoloxidase，as a terminal copper－containing metalloenzyme in this system，plays a key role in the non－specific immune defense of marine invertebrates by catalyzing melanization.In this paper，the research advances on immunological function，activation mechanism，biochemical and enzymatic properties，as well as gene and molecular structure of PO and proPO－AS are reviewed based on our research achievements and a large number of academic literatures in this field.

phenoloxidase；prophenoloxidase－activating system；marine invertebrates

Q55；Q814

A

1672－5174（2012）1－2－093－07

教育部骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目（160004）資助

2011－04－19；

2011－05－23

樊廷?。?964－），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。主要研究方向：動(dòng)物細(xì)胞工程與細(xì)胞分化。E－mail：tjfan＠ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 朱寶象