劉姍姍 彭忠異 文亦磊 崔錦珠 王進聲 張錫流

近年來研究表明，細胞生長和增殖信號的過度刺激及細胞凋亡的抑制等可以打破細胞增殖生長和死亡清除之間的平衡，進而可以引起腫瘤的發(fā)生。內(nèi)皮生長因子受體2(HER-2)是1種磷酸化受體蛋白,其在腫瘤中的過度表達,最終影響腫瘤細胞的增殖、分化和浸潤轉(zhuǎn)移。目前，有關(guān)HER-2在胃癌組織中表達的研究報道甚少，有關(guān)應(yīng)用熒光原位雜交(FISH技術(shù))結(jié)合傳統(tǒng)HE染色及免疫組化(IHC技術(shù))檢測胃癌標(biāo)本HER-2擴增及HER-2表達情況的報道更是罕見。我們應(yīng)用FISH技術(shù)及IHC技術(shù)，檢測HER-2擴增及HER-2基因表達情況；探討HER-2基因表達、擴增與胃癌生物學(xué)行為的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2009年～2011年存檔的胃癌活檢標(biāo)本20例。胃癌患者中，男性13例，女性7例；年齡35～78歲，中位年齡62歲。按WHO國際組織分類標(biāo)準：管狀腺癌(高、中分化型)12例，低分化型腺癌6例，未分化型腺癌2例。按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)臨床TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期8例;侵及漿膜層11例，未侵及漿膜層9例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例。胃癌患者活檢前均未接受過放化療及其它針對腫瘤的治療。

1.2 試劑與方法

GLP HER2/CSP 17探針、HER-2 FISH TM檢測試劑盒購自北京金菩嘉生物技術(shù)有限公司；即用型C-erbB-2兔抗人單克隆抗體、免疫組化Envision plus廣譜試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

FISH檢測方法：采用金菩嘉HER2 DNA FISH探針(標(biāo)記紅色熒光)，設(shè)對照探針(標(biāo)記綠色熒光),其中主要含DNA FISH探針和雜交緩沖液。標(biāo)本處理：①石蠟切片于65℃烤片過夜，常規(guī)脫蠟至水， 50℃下用30%酸性亞硫酸鈉處理組織切片20～30 min。2×SSC溶液中漂洗5 min×2次。②37℃蛋白酶K工作液中孵育20～30 min，然后在2×SSC溶液中漂洗5 min×2次，0.1M HCl中室溫浸泡5～10 min，再次在2×SSC溶液中漂洗5 min×2次。③脫水：玻片依次置于-20℃預(yù)冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各脫水2 min，再室溫浸入丙酮溶液中2 min，自然干燥玻片。FISH技術(shù)：①變性：73℃±1℃的70%甲酰胺變性液中浸泡5 min，然后依次置于預(yù)冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中進行梯度脫水各3 min。②雜交：10 μl探針混合液滴于玻片組織上,蓋上蓋玻片,橡皮膠封片。73℃變性5 min,42℃雜交過夜。③洗滌：在73℃的2×SSC/0.3% NP40洗脫液中洗滌2 min,再于室溫洗滌5 s,自然干燥。觀察結(jié)果：暗處自然干燥玻片，將15 μl DAPI復(fù)染劑滴加于雜交區(qū)域位置，立即蓋上蓋玻片。暗處放置10～20 min后，熒光顯微鏡下觀察。

免疫組化法(Envision二步法)：石蠟切片于65℃烤片2 h，常規(guī)脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗3 min×3次。pH6.0檸檬酸鹽緩沖液微波加熱修復(fù)10 min，PBS沖洗3 min×2次。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性：3% H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次。滴加一抗，室溫孵育2 h。PBS沖洗5 min×3次。滴加聚合物增強劑試劑A，室溫孵育20 min。PBS沖洗3 min×3次。滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物試劑B，室溫孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次。滴加DAB液，顯微鏡下觀察5 min。蘇木精復(fù)染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。

1.3 結(jié)果判斷

IHC技術(shù)檢測HER2蛋白表達結(jié)果判定[1]：無染色或<10%的細胞胞膜染色為“-”，>10%的細胞不完整胞膜染色為“+”，>10%的細胞有較弱的完整胞膜染色為“++”，>10%的細胞有較強的完整胞膜染色為“+++”?！?”和“+”視為無或低表達，“++”和“+++”視為過表達。FISH技術(shù)檢測HER2基因擴增結(jié)果判定[2]：正常細胞紅色信號/綠色信號為2∶2；異常細胞紅色信號>2且綠色信號≥2。計數(shù)30個細胞，統(tǒng)計Ratio值(Ratio值=同30個細胞核中紅/綠)。Ratio<1.8為“-”，無擴增；Ratio>2.2為“+”，擴增；Ratio在1.8～2.2之間時，增加計數(shù)細胞至100個加以判斷。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

IHC檢測20例胃癌組織中HER-2蛋白陽性表達6例，陽性率為30%；FISH檢測HER-2基因擴增7例，擴增率為35%。胃癌組織中HER-2/neu蛋白陽性表達及HER-2/neu基因擴增，均與患者性別、年齡和腫瘤分化程度無顯著相關(guān)性(P>0.05)，而與腫瘤浸潤深度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)，結(jié)果見表1、2。

表1 HER2蛋白表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

3 討論

3.1 HER2的檢測方法及技術(shù)

目前美國食品及藥物管理局( FDA)批準用于HER2檢測的方法有2種:即免疫組化法(IHC)和熒光原位雜交法(FISH)[3]。IHC法是檢測H ER2基因蛋白水平較常用的1種方法，它能對HER2癌基因進行定位,陽性者的細胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒；FISH法為檢測HER2基因擴增的1種方法,用于檢查分裂期細胞的核型、識別染色體數(shù)目,確定腫瘤細胞的來源[4]。

表2 HER2基因擴增與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

IHC和FISH具有需要組織少，可保持原有組織結(jié)構(gòu)并做形態(tài)學(xué)檢測的優(yōu)點，這既滿足了對不同區(qū)域癌組織的研究需要，又避免了樣本中非腫瘤成分的影響，在技術(shù)上IHC和FISH完全可完全標(biāo)準化和自動化。由于IHC實驗修復(fù)過程影響蛋白質(zhì)表達，因此對于HER2蛋白表達的研究,IHC無法避免假陽性。FISH檢測HER2基因的擴增時，DNA的穩(wěn)定性比蛋白質(zhì)強,實驗操作影響較小,且其結(jié)果定量判讀,盡量避免了主觀上的誤差。故本實驗綜合采用IHC和FISH 2種檢測方法。據(jù)文獻報道，在HER2高表達的乳腺癌標(biāo)本中，IHC與檢測基因水平的FISH全面符合率達96%[5]。在本研究中，胃癌HER2的表達檢測IHC與FISH全面符合率達95% ，與上述結(jié)果基本一致。

3.2 HER2與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

原癌基因HER2又稱c-ebrB-2，屬于表皮生長因子受體家族，定位于人染色體17q21，編碼1種分子量為185 kD的跨膜蛋白，在正常情況下處于非激活狀態(tài)[6]。HER2受體胞內(nèi)區(qū)有酪氨酸蛋白激酶PTK活性，自身也具有若干酪氨酸殘基Tyr磷酸化位點。特異性生長因子與HER2受體結(jié)合后可誘導(dǎo)二聚體化并激發(fā)受體的交叉磷酸化，磷酸化的受體可以把細胞外的生長信號迅速轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)，刺激控制與細胞分裂有關(guān)的基因表達。HER2基因可通過基因突變被激活，且其擴增將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄上調(diào)，蛋白合成增加，從而參與抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子VEGF/血管通透性因子VPF，促進腫瘤新生血管生成，增強腫瘤細胞侵襲力，破壞機體抗侵襲屏障等[7]。HER2癌基因擴增的產(chǎn)物可以通過不同的信號傳導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致細胞無序增殖和惡性轉(zhuǎn)化，HER2蛋白過表達在細胞的分裂、增殖、轉(zhuǎn)化、促進腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲、黏附中也發(fā)揮重要作用[8]。HER2基因擴增和(或)蛋白過表達往往提示腫瘤惡性程度高，轉(zhuǎn)移能力強。

3.3 HER2表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

目前，有文獻報道在結(jié)直腸癌中，HER2基因的擴增、突變與HER2蛋白表達有關(guān)[9]。HER2基因擴增和蛋白過表達廣泛存在于乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸癌和肺癌等惡性腫瘤中[10]。已經(jīng)證實20%～40%乳腺癌中存在HER2基因的擴增及過度表達，并認為HER2基因表達是乳腺癌獨立的預(yù)后因素[11]。本研究結(jié)果顯示，在20例胃癌組織中HER2基因擴增率為35%，HER2蛋白表達率為30%，HER2基因擴增和蛋白表達與患者性別、年齡無關(guān)，說明胃癌中HER2表達無性別、年齡差異；在不同分化程度的胃癌中，HER2蛋白陽性率及基因擴增率亦無顯著性差異，揭示了HER2表達與胃癌細胞分化程度無顯著相關(guān)性;而侵及漿膜層胃癌中HER2陽性表達率及基因擴增率顯著高于未侵及漿膜層者，提示HER2表達的胃癌組織局部侵襲性更大;伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌HER2陽性表達率及基因擴增率高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，這表明HER2參與了胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移過程；HER2陽性表達率及基因擴增率胃癌Ⅲ期和Ⅳ期中高于Ⅰ期和Ⅱ期，證明隨著腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移能力增強，HER2基因表達也增強，從而進一步促進了腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移，加速了病情的進展?？傊?，HER2在胃癌向中晚期發(fā)展、向深部組織浸潤、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過程中起著非常重要的作用。

3.4 HER2檢測的臨床價值與意義

近來，能特異性針對腫瘤靶點，從分子水平阻斷腫瘤惡性生物學(xué)行為，抑制腫瘤細胞生長的分子靶向治療MTT已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點[12]。HER2靶向抗體曲妥珠單抗(herceptin,赫賽汀)是1種重組DNA衍生的人源化單克隆抗體，選擇性地作用于HER2的細胞外部位，通過抑制HER-2 蛋白表達而達到抑制腫瘤細胞增殖的目的,適用于治療HER2過度表達的乳腺癌[13]。NCCN臨床治療指南己將Herceptin列為中高風(fēng)險早期乳腺癌患者輔助治療及轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療的基本用藥。對于Herceptin在胃癌上的使用因為HER2在胃癌的表達實驗結(jié)果不一，故其在胃癌上的使用經(jīng)驗不多。Tanner 等[14]報道HER2靶向抗體對有HER2基因擴增的胃癌和乳腺癌細胞N87和SKBP-3都一樣有抑制生長作用，Rebischunge等[15]證實HER2靶向抗體聯(lián)合化療對HER2基因過度表達的轉(zhuǎn)移性胃癌有效。本研究結(jié)果表明，在胃癌中HER2蛋白有較高的陽性表達率、HER2基因有較高的基因擴增率，這就為Herceptin在胃癌的治療提供了理論依據(jù)。

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