蔣棟磊， 孫秀蘭＊， 張銀志， 單曉紅，管 露， 尤繼明， 李紅梅

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；3.國家有機食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，江蘇 寶應(yīng) 225800）

小鼠過敏模型在食品過敏原分析中的研究與應(yīng)用

蔣棟磊1， 孫秀蘭＊1， 張銀志2， 單曉紅1，管 露1， 尤繼明3， 李紅梅3

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；3.國家有機食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，江蘇 寶應(yīng) 225800）

建立牛乳蛋白、河蝦蛋白的ICR小鼠過敏模型，檢測食品過敏原體外激發(fā)小鼠致肥大細胞的組胺釋放率，探討食品過敏原鑒定并驗證所建過敏原體外評價新方法。方法 以牛奶蛋白、河蝦蛋白，氫氧化鋁佐劑免疫ICR小鼠，建立IgE高反應(yīng)性食物過敏動物模型。間接ELISA測定激發(fā)后第7、14、21 d血清中過敏原sIgE水平；并在激發(fā)第14 d分離小鼠腹腔肥大細胞，過敏原體外激發(fā)，紫外分光光度法檢測類胰蛋白酶定向釋放水平。①模型小鼠血清sIg E水平明顯高于對照組，且在過敏激發(fā)后第14 d sIgE效價最高，河蝦組和牛奶蛋白組的sIg E效價分別達到1／25 600和1／12 800。②牛奶組類胰蛋白酶釋放率達38.5%；河蝦組的類胰蛋白酶釋放率達47.1%，所有模型組與對照組間差異均達顯著水平（P＜0.05）。建立了一種小鼠過敏模型，通過檢測過敏原體外激發(fā)類胰蛋白酶釋放率可以作為一種鑒定與評價食品過敏原的有效方法。

sIgE；類胰蛋白酶；肥大細胞；食品過敏原

食品過敏原的安全問題已引起廣泛的關(guān)注，其潛在的過敏源性是急需研究的新課題。過敏癥是在全世界廣泛流行的一類常見變態(tài)反應(yīng)性疾病，由于其癥狀復(fù)雜，種類繁多，危害廣泛且難以根治，成為長期以來醫(yī)學(xué)界的一大難題［1］，食品過敏原或混合物的分布范圍非常廣泛，包括農(nóng)作物、畜禽產(chǎn)品、水產(chǎn)品、水果、蔬菜等。世界糧農(nóng)組織（FAO）1995年報告［2］，90%以上的食物過敏是由牛奶、雞蛋、魚、貝殼海產(chǎn)品、花生、大豆、堅果類和小麥引起。

牛乳是母乳特別重要的替代品，也是新生兒最早接觸到的過敏原之一，因而牛乳過敏在嬰幼兒中最常見。通常引起牛奶過敏的過敏原主要有酪蛋白、β－乳球蛋和α－乳白蛋白，其中以β－乳球蛋白的過敏活性最高［3］。在發(fā)達國家 ，有2%～7.5%的嬰幼兒發(fā)生牛奶過敏癥這主要是由于其抗消化活性最高從而導(dǎo)致在腸內(nèi)不易失去過敏性的緣故。

蝦中過敏原組分有多種，2004年賴荷等研究發(fā)現(xiàn)，蝦中存在12種過敏原組分［4］，最主是相對分子質(zhì)量（M）為36 000左右的原肌球蛋白，由于不同過敏癥患者對不同過敏原組分的敏感度不同，同時獲得多種純化、單一過敏原組分較難，影響了蝦過敏癥診斷和過敏原檢測的靈敏度，導(dǎo)致蝦過敏原標(biāo)準(zhǔn)化的困難。

IgE介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是食品過敏的主要效應(yīng)，為I型超敏反應(yīng)，由Th2型T淋巴細胞的活化介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。在小鼠體內(nèi)，Th2反應(yīng)主要引起IgE和IgG1型抗體產(chǎn)生，而Th1反應(yīng)產(chǎn)生IgG2a型抗體［5］。脾臟是機體最大的免疫器官，當(dāng)血液中出現(xiàn)外源體時，脾臟中的巨噬細胞、淋巴細胞會發(fā)生免疫反應(yīng)，吞食外源體，結(jié)果造成脾臟腫大，因此可以把脾臟的外形變化作為鑒定致敏效果的指標(biāo)之一。

本研究用河蝦蛋白和牛奶蛋白免疫ICR小鼠，建立食物過敏癥動物模型，間接ELISA檢測過敏原特異性IgE效價，紫外法測定腹腔肥大細胞體外類胰蛋白酶定向釋放，證實成功建立了河蝦和牛奶過敏的動物模型，為建立體外過敏原評價體系奠定了基礎(chǔ)，為食品過敏原的標(biāo)準(zhǔn)化及解決食品中過敏原表示等問題提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

山羊抗小鼠IgE抗體：Sigma公司產(chǎn)品；precoll分離液：上海源葉生物公司產(chǎn)品；ICR小鼠：無錫惠山實驗動物養(yǎng)殖中心；96孔8×12可拆酶標(biāo)板：上海春博生物實驗儀器有限公司產(chǎn)品，Multiskan MK3酶標(biāo)儀：Thermo Labsystems公司產(chǎn)品；WFJ2000型722紫外分光光度計：上海市三分析儀器廠生產(chǎn)。

1.2 實驗動物與分組

ICR小鼠21只，雌性，6～8周齡，體重約16～18g，隨機分為3組：蝦蛋白致敏組、牛奶蛋白致敏組及PBS對照組，實驗組各9只，對照組3只。用不含河蝦蛋白和牛奶蛋白的特種飼料喂養(yǎng)。

1.3 過敏原制備

實驗用過敏原參照《變態(tài)反應(yīng)學(xué)實驗技術(shù)》［6］制備，過敏原蛋白經(jīng)過脫脂、浸提、冷凍離心后進行硫酸銨分級沉淀和等電點沉淀，經(jīng)透析后獲得比較純凈的過敏原蛋白。用考馬斯亮藍法進行蛋白質(zhì)定量，PBS稀釋到10 mg／m L，0.25μm微孔濾膜過濾除菌、分裝，－20℃貯存，備用。

1.4 小鼠免疫

小鼠飼養(yǎng)7 d后開始免疫，取1 mg／m L過敏原蛋白提取液與2.5 mg／m L Al（OH）3佐劑等體積混勻后，按分組腹腔注射0.2 m L／只，對照組注射等體積0.01 mol／L，p H 7.4 PBS，每隔一周激發(fā)1次，一共激發(fā)3次，期間觀察激發(fā)后小鼠過敏癥狀。各實驗組9只小鼠又分為3小組，分別在激發(fā)后第7、14、21 d各組分別眼球采血，分離血清，－20℃貯存?zhèn)溆?。小鼠處死后立即收集腹腔肥大細胞用于體外組胺釋放測定。

1.5 腹腔肥大細胞的分離和純化

腹腔肥大細胞的采集參照《肥大細胞體外脫顆粒的檢測方法》［7］中的方法加以改進。小鼠眼球采血處死后，向小鼠腹腔注射5 m L HBSS液，按摩小鼠腹部5 min，抽取腹腔液。將其緩慢注入到體積比30%∶80%的percoll梯度分離液中。室溫下1 000r／min離心10 min，吸出中間層的細胞，即為肥大細胞。用HBSS液調(diào)至10 m L／管，充分混勻后，1 500 r／min離心10 min，重復(fù)兩次。沖洗后的細胞重新懸浮于3 m L HBSS液中，置于4℃，備用。

1.6 肥大細胞的計數(shù)與鑒定

光鏡下計數(shù)，調(diào)細胞濃度至105個細胞／m L。分別用臺盼藍和甲苯胺藍染色，鏡下觀察活細胞和肥大細胞純度比例。按常規(guī)制作標(biāo)本，觀察過敏原激發(fā)前后肥大細胞形態(tài)變化。

1.7 小鼠脾臟觀察及占體重比值計算

取血前稱量小鼠的體質(zhì)量記作m1，解剖取脾臟稱取其質(zhì)量，記作m2，比較致敏組和對照組的m1／m2值，即脾臟占體重的百分比，來評價致敏作用的效果。

1.8 間接ELISA檢測小鼠血清過敏原sIgE

用p H9.4碳酸鹽緩沖液稀釋過敏原包板，4℃過夜，PBS－T（含體積分?jǐn)?shù)0.05%Tween－20）洗板5次，每次3 min；5 g／d L脫脂奶粉200μL孔封閉，37℃，濕盒中溫育2 h后洗板；加待測血清和陰性對照血清，37℃反應(yīng)2 h，同上洗滌；加山羊抗鼠IgE抗體（1∶5 000稀釋），37℃反應(yīng)2 h，同上洗滌；加底物OPD，37℃顯色15 min；2 mol／L H2SO450μL孔終止反應(yīng)，15 min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測量OD值（A450）。

1.9 體外類胰蛋白酶定向釋放測定

類胰蛋白酶活力測定采用專一性底物［8］α－N－苯甲酰－DL－精氨酸－P－硝基苯胺（Na－benzoyl－DL－arginine－P－nitroanilide，BAPNA）。BAPNA以20 g／L溶于二甲基亞砜，取40μL加入含1 m L細胞上清的Tris－HCl（0.1 mol／L，p H7.4）反應(yīng)緩沖液1.5 m L中，37℃反應(yīng)30 min后，加入0.5 m L 300 m L／L乙酸終止反應(yīng)。相應(yīng)的細胞被1.5 m L反應(yīng)緩沖液重懸后，經(jīng)過細胞破碎儀徹底破碎，其他處理方式同上清。在405 nm測光吸收值。以反應(yīng)緩沖液做參比調(diào)零。根據(jù)制定的類胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細胞上清中的類胰蛋白酶含量與細胞中的類胰蛋白酶含量。釋放率＝上清的類胰蛋白酶／（上清類胰蛋白酶＋胞內(nèi)類胰蛋白酶）×100%。校正類胰蛋白酶釋放率＝類胰蛋白酶釋放率－空白對照組類胰蛋白酶自發(fā)釋放率。

2 結(jié)果與分析

2.1 致敏小鼠過敏癥狀分析

第一次免疫后，致敏組ICR小鼠出現(xiàn)明顯過敏癥狀，前爪頻繁搔撓口鼻處，體毛直立，身體顫抖，呼吸頻率加快，精神萎靡，活動減少［9］；對照組無過敏癥狀，說明小鼠過敏癥模型建立成功。

2.2 肥大細胞計數(shù)鑒定及光鏡觀察

經(jīng)染色后光鏡下計數(shù)觀察：分離純化的腹腔肥大細胞臺盼藍染色，細胞數(shù)為105個／m L，活細胞占總細胞的94%，甲苯胺藍染色，純度91%。正常肥大細胞核較大，胞內(nèi)有許多致密小顆粒。光鏡觀察可見正常細胞呈圓球形，輪廓清楚、完整（見圖1）；牛奶、河蝦致敏組脫顆粒細胞形態(tài)變得不規(guī)則，表面出現(xiàn)一些空洞，輪廓模糊不清（如圖2、3）。

圖1 PBS對照組PMCFig.1 Peritoneal mast cell of PBS control group

圖2 牛奶致敏組PMCFig.2 Peritoneal mast cell of milk sensitized group

圖3 河蝦致敏組PMCFig.3 Peritoneal mast cell of shrimp sensitized group

2.3 脾臟觀察與稱重

激發(fā)后取小鼠脾臟，每周一次，連續(xù)3周，分別計算致敏組和PBS對照組脾臟占體質(zhì)量的比值（質(zhì)量百分比），發(fā)現(xiàn)致敏組小鼠脾臟占體重比值明顯大于對照組，說明發(fā)生了脾臟腫大，結(jié)果如圖4：

圖4 不同致敏組小鼠脾臟質(zhì)量比較Fig.4 Comparison of mice splean weight in different sensitized groups

2.4 模型小鼠血清sIgE水平

分別于初次免疫激發(fā)前（0 d）和激發(fā)后第7、14、21天檢測河蝦組、牛奶組及對照組小鼠血清過敏原slgE效價。結(jié)果判定以陽性O(shè)D值為陰性2.1倍為準(zhǔn)。不同時間及不同組別小鼠血清sIgE效價如表1所示。可見各組血清sIgE效價均在激發(fā)后第7天已上升，第14天達到最高，第21天又有所下降。從表1中還可看出免疫河蝦蛋白組比免疫牛奶組致敏效果更佳。

表1 過敏原激發(fā)的sIgE效價Tab.1 Titer of sIgE sensitized by allergen

2.5 類胰蛋白酶釋放率測定結(jié)果

因各組小鼠均在激發(fā)后第14天sIgE效價最高，故選擇在激發(fā)后第14天測定腹腔肥大細胞組胺定向釋放，結(jié)果如圖5。圖5為免疫牛奶組定向釋放率達38.5%，免疫河蝦組達到47.1%，對照組為5.7%。數(shù)據(jù)均為每組測量3只小鼠取平均值，t檢驗，所有實驗組與對照組比較呈顯著差異（P＜0.05）。

圖5 不同致敏組類胰蛋白酶釋放率Fig.5 Release rate of Trypsin in different groups

3 結(jié)語

食物過敏主要是I型過敏反應(yīng)（速發(fā)性過敏反應(yīng)），具體作用機制是肥大細胞膜特異性受體結(jié)合Ig E抗體，經(jīng)過抗原的交聯(lián)作用，激活了肥大細胞，促使其脫顆粒，釋放出多種類型的過敏介質(zhì)如組胺，而產(chǎn)生食物過敏癥狀，其中，全身性反應(yīng)（如血壓下降導(dǎo)致的休克）是最嚴(yán)重的反應(yīng)［10］。所以本研究選擇sIgE和組胺作為評價過敏狀態(tài)的指標(biāo)。

雖然Balb／c系小鼠受過敏原刺激后能產(chǎn)生高滴度的IgE，是常用于食物過敏性研究中的品系。但由于其價格昂貴，養(yǎng)殖要求比較高，死亡率較高，故本實驗選用ICR小鼠進行建模對象，據(jù)報道ICR果［14］表明類胰蛋白酶占肥大細胞蛋白酶的25%，在細胞上清液中含量較高，易于檢出，此外類胰蛋白酶的檢測方法簡單，不需要形成熒光物質(zhì)參與反應(yīng)，相比組胺的常規(guī)檢測有明顯優(yōu)勢，它能夠更精確、更穩(wěn)定的反映肥大細胞脫顆粒的程度，因此更適合作為檢測肥大細胞脫顆粒時的標(biāo)志物。因激發(fā)后第14天過敏原sIgE水平最高，故測定了第14天腹腔肥大細胞的類胰蛋白酶定向釋放率，實驗組都明顯高于對照組，統(tǒng)計分析呈顯著性差異，且與sIgE檢測結(jié)果相對應(yīng)。

此外，由于脾臟是機體最大的免疫器官，可以制造免疫球蛋白、補體等免疫物質(zhì)，發(fā)揮免疫作用。當(dāng)血液中出現(xiàn)病菌、抗原、異物、原蟲時，脾臟中的巨噬細胞、淋巴細胞會發(fā)生免疫反應(yīng)，吞食外源體，結(jié)果造成脾臟腫大，因此可以把脾臟的外形及重量變化作為鑒定致敏效果的指標(biāo)之一。實驗結(jié)果表明，致敏組小鼠脾重占體重比值明顯大于對照組，且河蝦致敏組的脾臟比值最大，說明致敏組小鼠體內(nèi)確實發(fā)生了較明顯的免疫反應(yīng)，且河蝦蛋白致敏效果更為明顯。

綜上本研究用河蝦、牛奶蛋白皮下免疫ICR小鼠建立了過敏癥模型 ，腹腔肥大細胞體外定向組胺釋放率和特異性Ig E水平檢測可用于食品過敏原鑒定與評價 ，對研究食物過敏癥的診斷和治療具有十分重要的意義。小鼠也是進行免疫藥物篩選，復(fù)制病理模型較常用的實驗動物，并且根據(jù)本研究結(jié)果看出，選用ICR作為實驗對象也能較好的得到需要的結(jié)果，小鼠經(jīng)過河蝦、牛奶蛋白的免疫體內(nèi)確實產(chǎn)生了較為強烈的免疫反應(yīng)，并通過血清效價和肥大細胞組胺釋放率表現(xiàn)出來。建立過敏模型主要有經(jīng)胃腸道（口服）和非胃腸道（腹腔或皮下注射）這兩大類途徑，雖前者更好模擬了食物引起人們過敏的途徑，但易導(dǎo)致免疫耐受；后者不但能避免口服耐受，且能引起更高滴度sIg E的產(chǎn)生［11］。本實驗選用了河蝦和牛奶兩種致敏原，通過腹腔注射致敏途徑建立動物模型。間接ELISA結(jié)果表明，無論注射河蝦組還是牛奶組均產(chǎn)生了較高滴度的sIgE抗體，分別在3個不同時間點檢測sIg E水平，激發(fā)后第14天IgE效價達到最高。比較河蝦組和牛奶組，結(jié)果顯示河蝦蛋白致敏效果要優(yōu)于牛奶蛋白。

肥大細胞在變態(tài)反應(yīng)性疾病發(fā)病機制具有核心作用，是連接變態(tài)反應(yīng)的誘導(dǎo)階段與效應(yīng)階段的紐帶，有將過敏原的信號放大的能力。組胺是經(jīng)典的過敏介質(zhì)，以往主要用來標(biāo)記肥大細胞脫顆粒的程度［12］，但是Schwartz等［13］曾報道組胺這種物質(zhì)在生理條件下半衰期很短，僅為幾分鐘，且釋放不夠穩(wěn)定，所形成的熒光物質(zhì)易分解，重復(fù)性差，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果的不穩(wěn)定。而類胰蛋白酶是肥大細胞內(nèi)預(yù)先合成的蛋白酶經(jīng)肥大細胞脫顆粒釋放出胞外與其他介質(zhì)一起參與過敏反應(yīng)。有研究結(jié)

（References）：

［1］聶凌鴻.食品過敏原研究進展［J］.生命的化學(xué)，2002（22）：474－477.

Nie ling－h(huán)ong the process of research in food allergen［J］.Chemistry of Life，2002（22）：474－477.（in Chinese）

［2］Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO Report of the FAO Technical Consultation on Food Allergies［R］.Rome：1995.

［3］BUORO S，F(xiàn)ERRARESE P，CH IAVEGATO A，et al，Myofibroblast－derived smooth muscle cells during remodeling of rabbit urinary bladder wall induced by partial outflow obstruction［J］.Lab Invest，1993，69（5）：589－590.

［4］Zwimer NW，F(xiàn)uertes MB，Ginm MV，et a1.Cytokine－driven regulation of NK cell functions in tumor immunity：Role of the MICA－NKG2D system［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2007，18（1）：159－70.

［5］Halstensen ST.Why are we not all allergic：basic mechanisms for tolerance development［J］.Environ Toxicol Phanmcol，1997，4：25－26.

［6］喬秉善.變態(tài)反應(yīng)學(xué)實驗技術(shù)［M］.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2002.6－36.

［7］郭薇，陳玉川，劉水平，等.肥大細胞體外脫顆粒的檢測方法［J］.中國病理生理雜志，2002，18（8）：1023－1025.

GUO wei，CHEN yu－chuan，LIU shui－ping et al.A new method on testing the degranulation of mast cells in vitro［J］.Chinese Journal of Pathophysiology，2002，18（8）：1023－1025.（in Chinses）

［8］LavensSE，ProudD，Warner JA.A sensitive colorimetric as assay for the release of tryptase from human lung mast cells［J］.J Immunol Methods，1993，166（1）：93－102.

［9］PEI C，ANDREW J，STUART K.Protein quality and physico－functionality of Australian sweet lupin（Lupinus angustifolius cv.Gungurru）protein concentrates prepared by isoelectric precipitation or ultrafiltration［J］.Food Chemistry，2003，83：575－583.

［11］Dearman RJ.Kimber I.Determination protein allergenicity：studies in mice［J］.Toxicology letters，2001，120：18－20.

［12］孫仁山.肥大細胞脫顆粒的標(biāo)志［J］.國外醫(yī)學(xué)·臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊，2001，22（2）：100－101.

SUN ren－shan.The symbol of Mast cells degranulation［J］.Foreign medical sciences，2001，22（2）：100－101.（in Chinses）

［13］Schwartz LB，AtkinsPC，Bradford TR，etal.Release of tryptase together with histamine during the immediate cutaneous response to allergen［J］.J Allergy Clin Immunol，1987，80（6）：850－855.

［14］郭永超，組胺、類胰蛋白酶、β－己糖胺酶在肥大細胞體外釋放過程中的相互關(guān)系［J］細胞與分子免疫學(xué)雜志。2009.25（12）：1073－1075.

GUO yong－chao.Investigation on the relationship among histamine，tryptase andβ－h(huán)exosam inidase in the process of mast cell degranulation［J］.Chinese journal of cellular and molecular immunology，2009.25（12）：1073－1075.（in Chinses）

Construction and Application of Allergic Models with ICR Mice in Vitro for Analysis of Food Allergens

JIANG Dong－Lei1，SUN Xiu－Lan＊1，ZHANG Yin－Zhi2，SH AN Xiao－h(huán)ong1，GUAN lu1，YOU Ji－ming3，LI Hong－mei3
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3 The National Center of Supervision and Inspection for Organic Food Quality；Bao YING 225800，China）

Objectives To establish allergic model with ICR mice for milk and shrimp protein，develop a novel technique based on determining histamine release from mouse sensitized cells stimulated in vitro for assessing and identifying food allergens.Methods The ICR mice were immunized by injection of river shrimp proteins or milk proteins with aluminum hydroxide as adjuvant.The sensitized mouse were challenged for one time at 7th day after sensitization.The sIgE of food allergens was measured by indirect ELISA at 7／14and 21days after challenge；and the peritoneal Mast cells were collected at 14th day and were stimulated by allergen in vitro.The liberation of tryptase was measured by ultraviolet spectrophotometry assay and was converted to releasing rate for statistical analysis with Student＇s system.Results①The levels of sIgE in the experimental groups were higher than on control at three different points.They reached the peak at14day after challenge，with a value of 1／25600 in river shrimp and 1／12800 in milk group.②The tryptase liberation ratio group was 38.5%in milk group and 36.14%in control group；The liberation ratio was 74.5%in river shrimp group and 47.1%in the control.All the model groups revealed significant difference compared with the control（P＜0.05）.Conclusion The present data indicated that tryptase release test with sensitized cells from mouse model challenged by food allergen in vitro maybe a prospective technique for assessing and identifying food allergens.

sIg E tryptase mast cell food allergy

TS 201.6

A

1673－1689（2012）05－0499－06

2011－06－21

國家自然科學(xué)基金項目（20806033）；國家“十二五”科技支撐計劃項目（2011BAK10B03）；國家973計劃項目（2012CB720804）；2010年度公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項項目（201003008－08）；江蘇省質(zhì)監(jiān)局立項項目（KJ122704）。

＊

孫秀蘭（1976－），女，山東聊城人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品安全檢測方面研究。E－mail：sxlzzz＠yahoo.com.cn