李增波，楊斌，李文斌，石國(guó)亮

（1.太原科技大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，山西 太原 030021；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 谷子研究所，山西 長(zhǎng)治 046011）

＊?dú)⒄婢劓溍咕鶤L－04發(fā)酵產(chǎn)抗生素工藝研究

李增波1，楊斌2，李文斌1，石國(guó)亮1

（1.太原科技大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，山西 太原 030021；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 谷子研究所，山西 長(zhǎng)治 046011）

為了提高殺真菌素鏈霉菌菌株AL－04的發(fā)酵濾液對(duì)植物病原真菌的抑菌活性，采用單因素試驗(yàn)和均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)其發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成分進(jìn)行了研究.結(jié)果表明，菌株AL－04產(chǎn)抗生素的最適發(fā)酵培養(yǎng)基為：黃豆粉34.0 g，魚粉12.0 g，蔗糖2.0 g，可溶性淀粉6.0 g，NaCl 2 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，ZnSO40.01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，CaCO32 g，蒸餾水1 000 mL；產(chǎn)抗生素的適宜發(fā)酵條件為：接種量10%，種子液菌齡36 h，裝液量50 m L／300 m L三角搖瓶，初始p H值7.2.在上述條件下，28℃、180 r／min振蕩培養(yǎng)7 d，菌株 AL－04的抑菌率比原始發(fā)酵培養(yǎng)基提高了13.6%，差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）.

殺真菌素鏈霉菌；均勻設(shè)計(jì)；抗生素；發(fā)酵工藝

鏈霉菌（Streptomycesspp.）屬于放線菌綱，是產(chǎn)生抗生素的重要微生物資源.菌株AL－04源于青藏高原土壤，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征和16S r DNA序列分析鑒定該菌株為殺真菌素鏈霉菌（Streptomyces fungicidicus）.其發(fā)酵濾液具有廣譜抗菌活性，且對(duì)多種園藝植物土傳真菌病害都有較好的防治效果（另文報(bào)道）.目前關(guān)于殺真菌素鏈霉菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的報(bào)道鮮見，國(guó)內(nèi)只有文才藝等［1－2］從遼寧省丹東地區(qū)的土壤樣品中分離到一株殺真菌素鏈霉菌YH9407，能夠產(chǎn)生四烯類抗生素；Li等［3］從太平洋5 000 m海底沉積土壤中分離到一株殺真菌素鏈霉菌，能夠產(chǎn)生低毒、防污染代謝物；Ramesh等［4］從印度洋孟加拉灣海底沉積土壤中篩選到一株殺真菌素鏈霉菌MML1614，能夠產(chǎn)生高活性蛋白水解酶.篩選殺真菌素鏈霉菌產(chǎn)生的抗真菌活性組分的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基是高效、大量生產(chǎn)該新型農(nóng)用抗生素的基礎(chǔ).均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)具有關(guān)鍵信息突出、試驗(yàn)處理少和簡(jiǎn)單易行等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛地應(yīng)用于試驗(yàn)和工藝研究［5］.本研究用單因素和均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菌株AL－04的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期為進(jìn)一步的中試放大和大面積推廣應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌種

供試鏈霉菌菌株AL－04，從青藏高原土壤分離純化的4 500余株放線菌中通過(guò)平皿體外試驗(yàn)篩選得到［6－7］；活性檢測(cè)指示菌為辣椒疫霉病菌（Phytophthoracapsici）.

1.2 培養(yǎng)基原料及主要試劑

葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、玉米粉、大米粉、黃豆粉、蛋白胨、酵母膏、酵母粉、魚粉、動(dòng)物水解氨基酸、硫酸銨、尿素.

1.3 培養(yǎng)基

改良PDA培養(yǎng)基［7］

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，酵母膏1 g，蛋白胨3 g，葡萄糖10 g，CaCO34 g，蒸餾水1 000 m L，p H 7.0.

原始發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆粉20 g，葡萄糖10 g，可溶性淀粉10 g，蛋白胨2 g，NaCl 2 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7 H2O 0.1 g，ZnSO40.01 g，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.01 g，CaCO32 g，蒸餾水1 000 m L，p H 7.0.

1.4 發(fā)酵濾液的制備

將菌株AL－04制成孢子懸浮液，孢子懸浮液按10%（V／V）的接種量接種于裝有50 m L發(fā)酵培養(yǎng)基的300 m L三角瓶中，28℃、180 r／min振蕩培養(yǎng)72 h，獲得種子培養(yǎng)液.將種子培養(yǎng)液按10%的接種量放入裝有50 m L發(fā)酵培養(yǎng)基的300 m L三角瓶中，28℃、180 r／min振蕩培養(yǎng)7 d.將發(fā)酵培養(yǎng)液5 000 r／min離心10 min，上清液再經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，得無(wú)細(xì)胞發(fā)酵濾液.

1.5 抑菌活性的測(cè)定

以辣椒疫霉病菌作為檢測(cè)菌，取2 m L無(wú)細(xì)胞濾液，按濾液∶培養(yǎng)基＝1∶10的比例與20 m L的改良PDA培養(yǎng)基（滅菌后冷卻至50℃左右）混合，待凝固后，將預(yù)先培養(yǎng)5 d的7 mm辣椒疫霉病菌菌餅放置于混配平板上，28℃培養(yǎng)72 h后將培養(yǎng)皿取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落直徑（十字交叉測(cè)量?jī)纱?，取平均值），?次平行菌落直徑的平均值計(jì)算抑菌率.

1.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

按照單因素設(shè)計(jì)，采用原始發(fā)酵培養(yǎng)基研究菌株AL－04不同發(fā)酵條件（發(fā)酵時(shí)間、接種量、種子液菌齡、裝液量、初始p H值）下的抑菌率.

1.7 碳源和氮源的篩選

1.7.1 碳源的篩選 選用原始發(fā)酵培養(yǎng)基中除碳源（葡萄糖和可溶性淀粉）以外的成分，分別加入可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、玉米粉、大米粉各20 g.發(fā)酵結(jié)束后制備發(fā)酵濾液，并測(cè)定這6種發(fā)酵濾液對(duì)辣椒疫霉病菌的抑菌率.

1.7.2 氮源的篩選 選用原始發(fā)酵培養(yǎng)基中除氮源（大豆粉和蛋白胨）以外的成分，分別加入大豆粉、酵母粉、魚粉、動(dòng)物水解氨基酸、硫酸銨、尿素各20 g.發(fā)酵結(jié)束后制備發(fā)酵濾液，并測(cè)定這6種發(fā)酵濾液對(duì)辣椒疫霉病菌的抑菌率.

1.8 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定可溶性淀粉、蔗糖、黃豆餅粉和魚粉4個(gè)因素的7個(gè)不同水平（表1），采用U7（74）均勻設(shè)計(jì)方案.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS軟件計(jì)算回歸方程，得到最佳培養(yǎng)基配方.

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳發(fā)酵時(shí)間的確定

搖床發(fā)酵培養(yǎng)2 d后每隔1 d取樣一次，測(cè)抑菌活性（圖1，P719）.結(jié)果表明發(fā)酵前兩天未檢測(cè)到抑菌活性，第3天開始具有抑菌活性，但活性很低；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)抑菌率不斷提高，培養(yǎng)至7 d時(shí)抑菌率達(dá)到最高點(diǎn)（抑菌率為78.6%），8 d后抑菌率開始下降，10 d后明顯下降，所以最佳發(fā)酵時(shí)間為7～8 d.本研究以下的試驗(yàn)均為發(fā)酵培養(yǎng)7 d.

2.2 種子液接種量對(duì)抑菌率的影響

將培養(yǎng)好的種子液按體積比以2%，4%，6%，8%，10%，15%和20%不同的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)7 d后測(cè)定發(fā)酵濾液抑菌率（圖2，P719）.結(jié)果表明接種量對(duì)抑菌率的影響較小，接種量為10%時(shí)，抑菌率最高，故本試驗(yàn)采用10%的接種量.

2.3 種子液菌齡對(duì)抑菌率的影響

將不同菌齡的種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，測(cè)定種子液菌齡對(duì)抑菌率的影響（圖3，P719）.結(jié)果表明：種子液菌齡對(duì)抑菌率影響較大，種子液菌齡過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都不利于抑菌率的提高，種子液最佳接種菌齡為36 h.

2.4 裝液量對(duì)抑菌率的影響

采用300 m L的三角瓶作為搖瓶，培養(yǎng)基裝液量分別為25 m L，50 m L，75 m L，100 m L，150 m L，滅菌后，培養(yǎng)36 h的種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)7 d后測(cè)定抑菌率（圖4，P719）.結(jié)果表明：裝液量為50 m L時(shí)抑菌率最高，加大裝液量對(duì)抗生素的產(chǎn)生不利，說(shuō)明菌株AL－04發(fā)酵過(guò)程中需要消耗大量氧.

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌率的影響Fig.1 Effect of fermentation filtrate at different fermentation time on inhibition rates

圖2 接種量對(duì)抑菌率的影響Fig.2 Effect of fermentation filtrate at different inoculum sizes on inhibition rates

圖3 種子液菌齡對(duì)抑菌率的影響Fig.3 Effect of different culture time of seed on Inhibition rates of fermentation filtrate

圖4 裝液量對(duì)抑菌率的影響Fig.4 Effect of different volume of media on Inhibition rates of fermentation filtrate

2.5 初始p H對(duì)抑菌率的影響

將配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后，用1.0 mol／L HCL或1.0 mol／L NaOH 調(diào)至p H 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定抑菌率（圖5）.結(jié)果表明：發(fā)酵培養(yǎng)基的初始p H 值對(duì)菌株 AL－04抑菌率影響明顯.初始p H值小于6.0時(shí)發(fā)酵液抑菌活性很低，p H值為7.0～8.0時(shí)的抑菌活性達(dá)到最高點(diǎn)，p H值為9.0時(shí)抑菌活性明顯下降.這說(shuō)明酸性條件下對(duì)菌株AL－04產(chǎn)抗生素具有抑制作用，微堿性有利于抑菌率的提高，p H值大于8.0時(shí)，抑菌率開始下降.

圖5 初始p H對(duì)抑菌率的影響Fig.5 Effect of different initial p H on Inhibition rates of fermentation filtrate

圖6 碳源對(duì)抑菌率的影響Fig.6 Effect of different carbon sources on Inhibition rates of fermentation filtrate

2.6 碳源的選擇

本試驗(yàn)采用了葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、玉米粉和大米粉等6種碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng).結(jié)果表明（圖6，P719）：以葡萄糖為單一碳源，抑菌率很低，說(shuō)明速效碳源對(duì)抑菌率影響很大；而采用遲效碳源如玉米淀粉、可溶性淀粉、玉米粉和大米粉時(shí)，抑菌率明顯提高，其中2.0%可溶性淀粉為單一碳源時(shí)抑菌率最高，故將可溶性淀粉作為最適碳源.

2.7 氮源的選擇

黃豆粉、玉米漿、蛋白胨、酵母膏、酵母粉、硫酸銨、尿素等均是常用的工業(yè)微生物發(fā)酵氮源，而魚粉和動(dòng)物水解氨基酸（簡(jiǎn)稱為氨基酸）均含有豐富的氨基酸和維生素類物質(zhì)，很適合工業(yè)發(fā)酵，但目前關(guān)于這兩種氮源的報(bào)道并不多，本試驗(yàn)采用了這兩種氮源作為備選氮源.結(jié)果表明（圖7），有機(jī)氮源明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，抑菌率從高到低依次為魚粉＞黃豆粉＞氨基酸＞酵母粉＞硫酸銨＞尿素.其中以魚粉作為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基合成的抗生素最多（抑菌率為80.4%），以黃豆粉為氮源，合成的抗生素次之（抑菌率為78.0%），考慮到生產(chǎn)成本及其他元素的含量變化對(duì)菌株AL－04抑菌率的影響，應(yīng)采用黃豆粉和魚粉的復(fù)合氮源做進(jìn)一步的均勻試驗(yàn)，以確定更好的發(fā)酵培養(yǎng)基配方.

2.8 培養(yǎng)基均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

在上述研究的基礎(chǔ)上，采用4個(gè)因素7個(gè)水平的U7（74）（表1）均勻設(shè)計(jì)方法［8］對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化.

圖7 氮源對(duì)抑菌率的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on Inhibition rates of fermentation filtrate

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基組分均勻設(shè)計(jì)及其試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Uniform design and its experiment results

在試驗(yàn)中，以配方用量為自變量，抑菌率為因變量采用DPS軟件［1－3］對(duì)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸，得回歸方程：

Y＝49.963 049 7－0.011 211 631 76X1×X2＋0.118 132 641 6X1×X4－0.163 128 197 36X2×X3－0.141 719 719 73X3×X4（R＝0.992 21F＝31.879 76S＝6.301 07P＜0.01）

查表F0.01＝19.21，F(xiàn)＞F0.01，F(xiàn)檢驗(yàn)通過(guò)，該擬合方程顯著性強(qiáng)，可信度高.

由方程直接可知菌株AL－04發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方為：黃豆粉34.0 g，魚粉12.0 g，蔗糖2.0 g，可溶性淀粉6.0 g，蔗糖2.0 g，NaCl 2 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7 H2O 0.1 g，ZnSO40.01 g，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.01 g，CaCO32 g，蒸餾水1 000 m L，p H 7.2.

為了進(jìn)一步確定所篩選的培養(yǎng)基配方的優(yōu)越性，將優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基（OM）和原始發(fā)酵培養(yǎng)基（CM）進(jìn)行抑菌率測(cè)定比較，分析表明，用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株AL－04所得的發(fā)酵濾液，在稀釋10倍后對(duì)辣椒疫霉病菌抑菌率達(dá)93.5%，比用原始發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵濾液的抑菌率（82.3%）高13.6%（P＜0.01）（表2，P721）.

表2 優(yōu)化與原始發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵濾液抑菌率的比較Table 2 Comparison of inhibition rate of strain AL－04 in culture filtrate from optimized and initial medium

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)殺真菌素鏈霉菌菌株AL－04產(chǎn)抗生素的發(fā)酵工藝研究，確定殺真菌素鏈霉菌菌株AL－04產(chǎn)抗生素的適宜發(fā)酵培養(yǎng)基為：黃豆粉34.0 g，魚粉12.0 g，蔗糖2.0 g，可溶性淀粉6.0 g，NaCl 2 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7 H2O 0.1 g，ZnSO40.01 g，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.01 g，CaCO32 g，蒸餾水1 000 m L；適宜發(fā)酵條件為：接種量10%，種子液菌齡36 h，裝液量50 m L／300 m L三角搖瓶，初始p H值7.2.在上述優(yōu)化條件下，28℃、180 r／min振蕩培養(yǎng)7 d，菌株AL－04的抑菌率比原始發(fā)酵培養(yǎng)基提高13.6%.

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Studies on Fermentation Technology forStreptomyces fungicidicus.Strain AL－04 Producing Antibiotics

LI Zeng－bo1，YANG Bin2，LI Wen－bin1，SHI Guo－liang1
（1.CollegeofChemicalandBiologicalEngineering，TaiyuanSci－TechUniversity，Taiyuan030021，China；2.InstituteofMillet，ShanxiAcademyofAgriculturalScience，Changzhi046011，China）

In order to obtain the high antagonistic effects ofStreptomycesfungicidicusAL－04 culture filtrate on plant pathogenic fungi，the medium and conditions were studied by using single factor experiment and uniform design.The results showed that the optimum medium for antibiotics production from strain AL－04 consisted of：soybean powder 34.0 g，fishmeal 12.0 g，sucrose 2.0g，starch 6.0 g，NaCl 2 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7 H2O 0.1 g，ZnSO40.01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，CaCO32 g and water 1 000 m L.The inhibition ratio increased by 13.6%after strain AL－04 was cultured at 28℃for 7 d at 180 rpm under the optimized culture conditions of inoculum size 10%，the seed liquid cultivated 36 h，culture medium amount 50 m L／300 m L flask and initial p H 7.2，which was significantly higher compared to the initial medium.

Streptomycesfungicidicus.；uniform design；antibiotics；fermentation technology

S476.1；Q939.9

A

0253－2395（2012）04－0717－05＊

2011－09－06；

2011－11－07

太原科技大學(xué)青年基金（20113008）；農(nóng)業(yè)部（天津市）產(chǎn)地環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助項(xiàng)目（批準(zhǔn)日期2010－06）

李增波（1981－），男，陜西安康人，講師，主要從事微生物資源及發(fā)酵工藝方面的研究.E－mail：lizengbo＠sina.com