喬錄新，張玉林，丁 渭，陳德喜

(首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院感染科，北京100069)

EGFP－線粒體蛋白導入載體的構建及功能驗證

喬錄新，張玉林，丁 渭，陳德喜*

(首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院感染科，北京100069)

目的 構建能夠?qū)⑼庠吹鞍讓胝婧思毎€粒體的真核表達載體，并且通過增強型綠色熒光蛋白的表達進行示蹤。方法 利用多重PCR擴增法將線粒體導肽序列與EGFP序列融合在一起，并插入真核表達載體pcDNA3.1，構建成真核表達載體pcDNA5.1-EGFP。將P53基因分別插入pcDNA5.1-EGFP和pcDNA3.1構建成pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53載體。經(jīng)酶切和測序驗證后在脂質(zhì)體介導下分別將上述載體轉(zhuǎn)染293T細胞，一方面在熒光顯微鏡下比較綠色熒光蛋白與細胞色素C在細胞內(nèi)的分布情況，另一方面通過免疫熒光法比較P53蛋白在細胞內(nèi)的定位。結果 綠色熒光的表達分布與細胞色素C具有一致性，且轉(zhuǎn)染pcDNA5.1-P53載體的細胞內(nèi)P53蛋白集中在胞質(zhì)線粒體中，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-P53載體的細胞內(nèi)P53蛋白主要分布在細胞核內(nèi)。結論 成功構建能夠?qū)⑼庠吹鞍讓刖€粒體的真核表達載體。

表達載體;綠色熒光蛋白;線粒體導肽

線粒體是真核細胞重要的細胞器，是人體的動力工廠，無論是細胞的成活(氧化磷酸化)和細胞死亡(凋亡)均與線粒體功能有關，特別是呼吸鏈的氧化磷酸化異常與許多人類疾病有關。自從Luft等［1］首次報道1例線粒體肌病以來，因線粒體功能障礙導致的疾病已累及全身多個系統(tǒng)，其中以神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉系統(tǒng)受累表現(xiàn)突出，近年來有發(fā)現(xiàn)線粒體與各種腫瘤的發(fā)生有密切關系［2］。因此有關線粒體的研究已經(jīng)成為人們關注的焦點。

每個線粒體內(nèi)大約含有1 000～1 500種蛋白質(zhì)［3］。這些蛋白質(zhì)大部分都是由細胞核DNA編碼經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯并在細胞質(zhì)核糖體合成后運入線粒體的，參與電子傳遞和ATP合成、三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化或氨基酸降解等重要生理過程，與眾多線粒體疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關系。因此，對這些蛋白質(zhì)在生理及病理狀態(tài)下的變化趨勢及相互關系的研究是一項十分必要和有意義的工作。本研究構建含有線粒體導肽的真核表達載體，并且在載體上加有EGFP示蹤其蛋白的表達情況，為研究線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的功能及相互作用提供直觀便捷的工具。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

限制性內(nèi)切酶ApaⅠ，XbaⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ，DNA Marker，T4 DNA Ligase，Taq酶(Takara公司);質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒(博邁德生物科技有限公司);細胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin(Invitrogen公司);JM109感受態(tài)(北京全式金生物科技有限公司);鼠抗細胞色素C抗體(Zymed Lab公司);鼠抗P53抗體(Sigma公司)。

1.2 引物與載體

1.2.1 引物:Cyc-S1:5'-TGGCAAGAGAGGGGGTTC TCATCATCATCATCAT-3'，Cyc-S2:5'-TTAGCCTAAT TGGCAAGAGAGGGGGTTCTCATCATC-3'，Cyc-S3:5'-ACCAGGGCACTTAGCCTAATTGGCAAGAGAGGGGG-3'，Cyc-S4:5'-CCATGTTGGCTACCAGGGCACTTAG CCTAATTGGCA-3'，Cyc-S5:5'-AGCAAGCTTGCCAC CATGTTGGCTACCAGGGCACTTAGCC-3'，Cyc-AS:5'-AGCGGGTTTAAACGGGCCCTC-3';P53-S:5'-TATCT AGAGAGGAGCCGCAGTCA-3'，P53-AS:5'-GAGGGC CCAGTCTGAGTCAG-3'。引物的合成及測序均由上海生工生物技術有限公司完成。

1.2.2 載體:pGEM-T easy載體(Promega公司)，pcDNA4.1-EGFP載體(本實驗室構建EGFP插入位點為KpnⅠ和XbaⅠ)，pcDNA 3.1載體(Invitrogen公司)，pCMV-P53載體(Clontech公司)。

1.3 細胞系及培養(yǎng)

人腎上皮細胞系(293T細胞，中國科學院)，在含有10%滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 PCR擴增EGFP目的片段和線粒體導肽融合序列

PCR 1:引物:Cyc-S1，CYC-AS;模板:pcDNA4.1-EGFP;PCR反應體系:pcDNA4.1-EGFP 50 ng，引物200 nmol/L，DNA 聚合酶1 μL，dNTP 200 nmol/L，終體積50 μL;反應條件:94 ℃ 1 min;94℃ 15 s，65℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)。

PCR 2:引物:Cyc-S2，CYC-AS;模板:1 μL PCR1產(chǎn)物;PCR 條件:每50 μL體系中加1 μL PCR 1產(chǎn)物，引物200 nmol/L，DNA 聚合酶1 μL，dNTP 200 nmol/L;反應條件:94℃ 1 min;94℃ 15 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)。PCR 2產(chǎn)物的純化、連接、轉(zhuǎn)化及驗證:二輪產(chǎn)物行0.8%瓊脂糖電泳后切膠回收(參照試劑說明書進行)，與pGEMT easy載體連接，連接方法參照Takara T4 DNA Ligase說明書。將上述連接產(chǎn)物pGEM-T-PCR2轉(zhuǎn)化至JM109細胞內(nèi)，氨芐抗性篩選克隆并提取質(zhì)粒，EcoRⅠ酶切驗證，具體步驟參照精編分子生物學實驗指南［4］。

PCR 3:引物:Cyc-S3;CYC-AS模板:pGEM-TPCR2質(zhì)粒。反應體系:pGEM-T-PCR2質(zhì)粒50 ng，引 物 200 nmol/L， DNA 聚 合 酶 1 μL， dNTP 200 nmol/L，終體積為50 μL體積，反應條件:94 ℃1 min;94 ℃ 15 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)。

PCR 4:引物:Cyc-S4;CYC-AS 模板:1 μL PCR3產(chǎn)物;PCR 條件:每50 μL體系中加1 μL PCR3 產(chǎn)物，引物200 nmol/L，DNA 聚合酶1 μL，dNTP nmol/L。反應條件:94℃ 1 min;94℃ 15 s，65℃30 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)。PCR 4產(chǎn)物的純化，連接、轉(zhuǎn)化及驗證具體操作同PCR2。

PCR 5:引物 Cyc-S5;CYC-AS模板:pGEM-T-PCR4(PCR4擴增TA克隆質(zhì)粒)質(zhì)粒;反應體系:PGEM-T-PCR4質(zhì)粒50 ng，引物200 nmol/L，DNA 聚合酶1 μL，dNTP 200 nmol/L。終體積為50 μL體積;反應條件:94℃ 1 min;94℃ 15 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)。PCR 5產(chǎn)物的純化、連接、轉(zhuǎn)化及驗證具體操作同上。

1.5 PCR擴增P53基因

PCR6:引物P53-S，P53-AS;模板:pcmv-P53質(zhì)粒;反應體系:pCMV-P53質(zhì)粒50 ng，引物200 nmol/L，DNA 聚合酶1 μL，dNTP 200 nmol/L，終體積為50 μL;反應條件:94℃ 2 min;94℃15 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，30個循環(huán)。PCR 6產(chǎn)物的純化、連接、轉(zhuǎn)化及驗證:PCR 6產(chǎn)物行0.8%瓊脂糖電泳后切膠回收，與pGEM-T easy載體連接，連接方法參照Takara T4 DNA Ligase說明書。將上述連接產(chǎn)物pGEM-T-PCR6轉(zhuǎn)化至JM109細胞內(nèi)，氨芐抗性篩選克隆并提取質(zhì)粒，EcoRⅠ酶切及測序驗證，具體步驟參照精編分子生物學實驗指南［4］。

1.6 pcDNA5.1-EGFP載體構建

限制性內(nèi)切酶HindⅢ 和ApaⅠ雙酶切pGEMT-PCR5正確質(zhì)粒，回收含有線粒體導肽序列的EGFP目的片段，并用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和ApaⅠ雙酶切pcDNA3.1載體，回收載體大片段，連接轉(zhuǎn)化提取質(zhì)粒步驟同上，HindⅢ和ApaⅠ酶切及測序驗證，陽性克隆命名為pcDNA5.1-EGFP(因為該質(zhì)粒上帶有線粒體導肽序列，為了和原有pcDNA3.1質(zhì)粒區(qū)別，特命名為pcDNA5.1-EGFP)。

1.7 pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53載體構建

限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和ApaⅠ雙酶切pGEM-TPCR6正確質(zhì)粒，回收P53目的片段，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和ApaⅠ切 pcDNA5.1-EGFP和 pcDNA3.1載體，分別回收載體大片段，連接轉(zhuǎn)化提質(zhì)粒步驟同上，提取質(zhì)粒ApaⅠ酶切及測序驗證讀碼框正確，陽性克隆命名為pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53。

1.8 免疫熒光

293T細胞從液氮中取出復蘇后，傳代。轉(zhuǎn)染前1天，胰蛋白酶消化細胞并計數(shù)，將細胞鋪到6孔板(3盤)，細胞匯合為60% ～80%時轉(zhuǎn)染。取1 μg質(zhì)粒DNA，按Lipofectin試劑操作說明進行轉(zhuǎn)染。其中1盤細胞轉(zhuǎn)染pcDNA5.1-EGFP，另外兩盤細胞分別轉(zhuǎn)染 pcDNA5.1-P53(實驗組)和pcDNA3.1-P53(對照組)。轉(zhuǎn)染后，3盤細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，做如下處理:PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定，含 5%BSA、0.25%Triton-X-100的 PBS封閉2 h。轉(zhuǎn)染pcDNA5.1-EGFP質(zhì)粒的細胞加入鼠抗細胞色素c抗體，室溫下孵育1 h，PBS洗3次，加入熒光素標記兔抗鼠IgG，室溫下避光孵育1 h，PBS漂洗后封片;pcDNA5.1-P53實驗組細胞和pcDNA3.1-P53對照組細胞分別加鼠抗P53抗體室溫下孵育1 h，PBS洗3次，加入熒光素標記兔抗鼠IgG，室溫下避光孵育1 h，PBS漂洗去除二抗，加入DAPI染色液室溫作用15 min以上，PBS漂洗3次后封片;于熒光顯微鏡下觀察細胞色素C，綠色熒光蛋白以及兩組P53蛋白在細胞內(nèi)的分布情況。

2 結果

2.1 目的基因EGFP-線粒體導肽的獲取

以pcDNA4.1-EGFP載體為模板經(jīng)過5次重復PCR擴增，利用引物附加堿基的多重擴增PCR方法將引物中添加的線粒體導肽序列與質(zhì)粒原有EGFP序列融合在一起。線粒體導肽序列為:ATGTTGGCT ACCAGGGCACTTAGCCTAATTGGCAAGAGA(MLAT RALSLIGKR)，序列參照大鼠線粒體細胞色素C氧化亞基 mRNA序列設計添加［5］(圖1)。

多重PCR擴增添加線粒體導肽步驟(圖2)。

EcoRⅠ酶切pGEM-T-PCR5質(zhì)粒，電泳顯示有兩條帶分別位于870 bp和3 000 bp左右(圖3)，測序驗證已經(jīng)成功擴增出EGFP基因序列并帶有線粒體導肽序列。

2.2 重組載體pcDNA5.1-EGFP酶切鑒定

pcDNA5.1-EGFP陽性克隆經(jīng)HindⅢ和ApaⅠ雙酶切后電泳在870 bp和5 500 bp處有條帶，而雙酶切pcDNA3.1載體僅在5 500 bp有一條帶，實驗結果與預期相符(圖4A)，測序驗證讀碼框正確表明得到正確質(zhì)粒pcDNA5.1-EGFP(圖4B)。

2.3 pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53載體構建

以pCMV-P53質(zhì)粒為模板PCR擴增P53基因分別連接到pcDNA5.1-EGFP和pcDNA3.1，酶切鑒定(圖5)，pcDNA5.1-P53質(zhì)粒陽性克隆經(jīng)XbaⅠ和ApaⅠ雙酶切有兩條帶分別位于6 200 bp和1 100 bp(圖5A)，pcDNA3.1-P53陽性克隆雙酶切后兩條帶分別位于5 500 bp和1 100 bp(圖5B)，與預期結果相符，進一步測序驗證讀碼框正確，表明得到P53基因插入的質(zhì)粒pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53。

圖1 EGFP-線粒體導肽序列結構Fig 1 The structure of EGFP-mitochondrial transit peptide sequence

圖4 重組載體pcDNA5.1-EGFP酶切鑒定及其結構圖Fig 4 Identification of recombinant vector pcDNA5.1-EGFP by restriction analysis and its scheme

圖5 pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53質(zhì)粒鑒定Fig 5 Identification of pcDNA5.1-P53 plasmid and pcDNA3.1-P53 plasmid

2.4 pcDNA5.1-EGFP、pcDNA5.1-P53 或 pcDNA3.1-P53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后熒光定位分析

pcDNA5.1-EGFP轉(zhuǎn)染293T細胞做細胞色素C免疫熒光處理后在顯微鏡下觀察細胞色素C的定位與綠色熒光蛋白的細胞定位具有一致性(圖6A)。pcDNA5.1-P53或pcDNA3.1-P53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞做P53免疫熒光處理，在熒光顯微鏡下觀察，pcDNA5.1-P53轉(zhuǎn)染細胞表達的P53蛋白集中定位在胞質(zhì)線粒體，而pcDNA3.1-P53質(zhì)粒表達P53蛋白定位在細胞核(圖6B)，DAPI染色將所有細胞核均染為藍色。上述結果表明所構建線粒體蛋白導入載體pcDNA5.1-EGFP是成功的。

3 討論

線粒體雖然有自己的DNA，但是其內(nèi)98%以上的蛋白質(zhì)是由胞核基因組DNA編碼的，并在胞質(zhì)內(nèi)由游離核糖體合成，再送到這些細胞器中去的［6－7］。目前認為大部分線粒體蛋白質(zhì)之所以能夠進入線粒體與其N端帶有的一肽段有關，這段肽段被稱為導肽，又稱轉(zhuǎn)運肽(transit peptide)或?qū)蛐蛄?targeting sequence)。導肽內(nèi)含定向運往線粒體的信息。導肽序列中不含有或基本不含有帶負電荷的酸性氨基酸，并且有形成兩性α螺旋的傾向，這種特征性的結構有利于穿過線粒體的雙層膜［8－9］。本研究中所選取導肽序列為目前公認的大鼠線粒體細胞色素C亞基IV的導肽(presequences)序列，它可以介導外源蛋白質(zhì)進入線粒體。1985年Eduard C.Hurt等就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)線粒體細胞色素C氧化亞基IV導向序列的前12個氨基酸可以介導小鼠二氫葉酸還原酶進入線粒體基質(zhì)，并且發(fā)現(xiàn)了第二個導向序列裂解點。同時，他們將線粒體導向序列中17～22個氨基酸去掉后發(fā)現(xiàn)，剩余序列仍能夠介導細胞色素C氧化亞基IV進入線粒體內(nèi)膜外側(cè)，參與組裝完整的細胞色素C氧化酶復合體［10］。

圖6 pcDNA5.1-EGFP、pcDNA5.1-P53或pcDNA3.1-P53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞熒光觀察Fig 6 Transfection of pcDNA5.1-EGFP，pcDNA5.1-P53 and pcDNA3.1-P53 plasmid into 293T cell

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一個生物發(fā)光系統(tǒng)具有性質(zhì)穩(wěn)定、無細胞毒性、靈敏性、檢測便捷等優(yōu)點，在熒光顯微鏡下，可直接觀察到活細胞中的GFP綠色熒光，因此作為研究與之融合的其他蛋白表達的報告基因受到人們的關注。EGFP是優(yōu)化的突變型GFP，其所產(chǎn)生的熒光要比野生型GFP強35倍，大大增強了該報告分子的靈敏度［11］。本研究利用多重PCR將線粒體細胞色素C氧化亞基IV導向序列的前12個氨基酸基因序列利用引物5'端附加堿基的方法與EGFP融合，并插入真核表達載體pcDNA3.1，轉(zhuǎn)染細胞后表達的熒光蛋白，借助線粒體導肽與線粒體膜上的受體結合，并進入線粒體。因而憑借熒光顯微鏡可以觀察到熒光蛋白在線粒體內(nèi)的表達及分布情況，無需共轉(zhuǎn)染其他帶有熒光的質(zhì)粒，操作簡單可靠。

P53蛋白在細胞內(nèi)起著整合的作用，正常情況下，該蛋白在所有類型的細胞內(nèi)都存在且位于細胞核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄因子的功能［12］。本研究將P53基因插入構建的載體后轉(zhuǎn)染細胞，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要集中在線粒體內(nèi)。進一步證明，所構建載體的導肽能夠?qū)⑼庠吹鞍讓蚓€粒體。同時，由于本載體本身在EGFP兩端具有內(nèi)切酶HindⅢ、XbaⅠ、ApaⅠ等酶切位點，方便外源蛋白基因的插入，轉(zhuǎn)染細胞后與EGFP形成融合蛋白在導肽的介導下共同進入線粒體表達。觀察熒光蛋白的表達情況，就可以示蹤外源基因在線粒體的表達，使相關實驗變得更為簡單、直觀，尤其是在活細胞或活體觀察方面具有很大的優(yōu)勢。因此，所構建的載體pCDNA5.1-EGFP是一種直觀便捷的工具，將有助于更好地研究線粒體蛋白的定位機制，功能及相互關系，進而有助于線粒體及其相關疾病的研究，具有良好的應用前景。

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Construction of the mitochondrial protein imported vector with EGFP and confirmation

QIAO Lu-xin，ZHANG Yu-lin，DING Wei，CHEN De-xi*

(Dept．of Infectious Diseases，the Affiliated Beijing Youan Hospital of Capital Medical University，Beijing100069，China)

ObjectiveTo construct a eukaryotic expression vector which can transport foreign protein into mitochondria．MethodsThe mitochondrial transit peptide's sequences were fused with EGFP through multiplex PCR amplification and inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1，constructing the eukaryotic expression vector pcDNA5.1-EGFP．Then the P53 gene was inserted into pcDNA5.1-EGFP and pcDNA3.1，constructing pcDNA5.1-P53 and pcDNA3.1-P53 vector．After verification by restriction enzyme digestion and sequencing，the plasmids were transfected into 293T cells for profiling the distribution of EFGP and cytochrome C in the cell，and the positioning of P53 protein in the cell．ResultsThe distribution of EGFP was consistent with cytochrome C，and the P53 protein expressed by pcDNA5.1-P53 was concentrated in mitochondria in the cytoplasm，while the vector pcDNA3.1-P53 was mainly distributed in the nucleus．ConclusionsThe eukaryotic expression vector was successfully constructed，which may transport foreign protein into the mitochondria．

expression vector;green fluorescent protein;mitochondrial transit peptide

R 34

A

1001-6325(2012)09-0992-06

2011－04－25

2011－12－15

國家“十一五”傳染病重大專項(2008ZX10001－004，2008ZX10001－007);國家自然科學基金(30910103915，30870853)

*通信作者(corresponding author):dexi09@yahoo．com