譚美華，陳建蘇

(1.暨南大學第一臨床醫(yī)學院眼科;2.暨南大學醫(yī)學院眼科研究所，廣東廣州510632)

體外細胞組織重建中共培養(yǎng)技術(shù)的應用

譚美華1，陳建蘇2*

(1.暨南大學第一臨床醫(yī)學院眼科;2.暨南大學醫(yī)學院眼科研究所，廣東廣州510632)

細胞共培養(yǎng)體系在維持細胞基本結(jié)構(gòu)和性狀的基礎(chǔ)上，通過兩種或多種細胞組織的相互作用，使體內(nèi)外環(huán)境盡可能相吻合，彌補了單層細胞培養(yǎng)的缺陷，有利于構(gòu)建更加接近生理狀態(tài)的重建體外細胞組織，被廣泛應用于現(xiàn)代細胞研究，成為角膜、牙周、軟骨、心血管以及神經(jīng)細胞組織等體外構(gòu)建的重要技術(shù)應用。在干細胞研究中，多孔膜兩側(cè)直接接觸共培養(yǎng)日益受到重視，三維細胞共培養(yǎng)將是未來發(fā)展的方向。

細胞共培養(yǎng);干細胞;組織工程

細胞培養(yǎng)技術(shù)已成為當今生命科學各研究領(lǐng)域的一項基礎(chǔ)技術(shù)和技能，是細胞工程、基因工程和生物醫(yī)學工程的重要研究手段。細胞離體后獨立生存于人工培養(yǎng)環(huán)境中，和體內(nèi)對應細胞在行為上的許多差異主要源于體外培養(yǎng)的細胞喪失了三維幾何的空間環(huán)境，組織學所特有的異型性細胞間相互作用不復存在。20世紀80年代后期發(fā)展的細胞共培養(yǎng)技術(shù)是將兩種或兩種以上的細胞或細胞與載體培養(yǎng)于同一環(huán)境中的技術(shù)，建立的培養(yǎng)體系在維持細胞基本結(jié)構(gòu)和性狀的基礎(chǔ)上，更加注重多種細胞組織在三維空間的相互作用，使體內(nèi)外環(huán)境盡可能相吻合，彌補了單層細胞培養(yǎng)的缺陷，被廣泛應用于現(xiàn)代細胞研究中。更好地觀察細胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用及可增加干細胞分化的可塑性，使得共培養(yǎng)技術(shù)在體外細胞組織重建的應用更加廣泛。

1 細胞共培養(yǎng)體系建立的方法

1.1 二維共培養(yǎng)

1.1.1 直接接觸共培養(yǎng):1)多微孔膜兩側(cè)細胞接觸共培養(yǎng)。通過插入式培養(yǎng)皿小室底部多孔膜的孔徑使兩側(cè)細胞直接接觸，既有可溶性分泌因子的相互交流，又能形成兩側(cè)細胞胞質(zhì)間的連接，同時能限制細胞的遷移，這些優(yōu)勢使得這種培養(yǎng)方式日益受到重視。在插入小室底部聚酯膜的內(nèi)外兩側(cè)分別接種人髓核細胞和自體骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchyme stem cell，BMSCs)進行直接接觸共培養(yǎng)，髓核細胞增殖、DNA合成和蛋白多糖含量均顯著增加，BMSCs能夠增強髓核細胞的生物活性，對共培養(yǎng)后的髓核細胞進行檢驗并未發(fā)現(xiàn)有染色體異常及腫瘤形成，為該模型應用于人體內(nèi)移植提供了更加有力的證據(jù)［1］。多孔膜兩側(cè)接種人胚胎干細胞和人脂肪干細胞共培養(yǎng)，可使胚胎干細胞在保持干細胞特性的同時進一步擴增，且與飼養(yǎng)層細胞分離，避免了傳代過程中酶的使用和飼養(yǎng)層細胞的污染，并用人脂肪干細胞代替了傳統(tǒng)的動物細胞，增加了胚胎干細胞應用于臨床的可靠性［2］。2)混合細胞共培養(yǎng)。在一定條件下將兩種或兩種以上細胞以一定比例接種在同一培養(yǎng)皿中，使不同種類細胞直接接觸，是較早應用的直接接觸共培養(yǎng)方法。在經(jīng)化學物質(zhì)誘導后的脂肪干細胞中加入小鼠神經(jīng)細胞瘤與大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤之融合細胞NG108-15細胞株，共培養(yǎng)后NG108-15細胞中有神經(jīng)突起的細胞數(shù)、每個細胞的神經(jīng)突起數(shù)和最長突起的長度與單獨培養(yǎng)相比均有增加，表明脂肪干細胞能夠促進神經(jīng)突的生長和延長［3］。通過建立大鼠BMSCs與平滑肌細胞的各種共培養(yǎng)體系，觀察到只有兩種細胞直接接觸可誘導BMSCs向平滑肌細胞分化［4］。

1.1.2 非直接接觸式共培養(yǎng):將插入式培養(yǎng)皿放入相應規(guī)格的細胞培養(yǎng)板中，上下兩層接種不同的細胞，通過培養(yǎng)液的成分相通作用，觀察一種細胞對另一細胞的影響，是目前常用的一種共培養(yǎng)方式。在非直接接觸共培養(yǎng)模型中脂肪干細胞可通過旁分泌作用促進鼓膜成纖維細胞增殖和遷移，有利于鼓膜纖維層的修復［5］。為研究BMSCs的分化狀態(tài)對軟骨細胞行為的影響，對BMSCs進行不同處理后與軟骨細胞非直接接觸共培養(yǎng)，觀察到用成骨細胞培養(yǎng)基或基礎(chǔ)培養(yǎng)基前期誘導分化4 d的BMSCs可使軟骨細胞的黏多糖顯著增加［6］。

1.2 三維細胞共培養(yǎng)

三維培養(yǎng)中細胞通過緊密連接或縫隙連接等方式建立聯(lián)系，在基因表達、基質(zhì)分泌及細胞功能活動等方面與二維培養(yǎng)均有明顯差異，而與體內(nèi)細胞生長情況更為相似。將人臍靜脈內(nèi)皮細胞與人肝細胞放在合成的聚醚醚酮-聚氨酯及殼聚糖膜上建立共培養(yǎng)系統(tǒng)，膜的一些特性可促進細胞黏附并誘導內(nèi)皮細胞毛細管樣結(jié)構(gòu)形成以及ECM蛋白分泌，此共培養(yǎng)系統(tǒng)可顯示肝臟的分泌功能并用于肝臟組織的生物制造［7］。在自制的聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly(lactic-co-glycolic)acid，PLGA］支架上接種經(jīng)成骨細胞培養(yǎng)基前期誘導分化的BMSCs，在負載聚乙二醇［poly(ethylene glycol，PEG)］的水凝膠上接種軟骨細胞，再將兩種材料聚合進行三維共培養(yǎng)，觀察到BMSCs能夠促進軟骨細胞黏多糖增加［6］。

1.3 其他

1)用一種細胞的培養(yǎng)上清液與另一種細胞共培養(yǎng)。收集小鼠胚胎干細胞的條件培養(yǎng)基，以25%的比例加入到角膜內(nèi)皮培養(yǎng)基后培養(yǎng)人角膜內(nèi)皮細胞，多邊形內(nèi)皮細胞傳至第6代時體積不變大，Ki67蛋白陽性細胞數(shù)、集落形成率、進入S和G2期的細胞數(shù)均高于普通培養(yǎng)組，說明胚胎干細胞條件培養(yǎng)基能夠增強人角膜內(nèi)皮細胞的體外擴增能力［8］。2)用細胞裂解液或組織勻漿液與另一種細胞共培養(yǎng)。將兔角膜緣基質(zhì)制成勻漿再添加DMEM/F12培養(yǎng)毛囊干細胞，角蛋白K12明顯表達，提示角膜緣基質(zhì)勻漿液能提供類似體內(nèi)角膜緣微環(huán)境中的因子，促進毛囊干細胞向角膜上皮細胞分化［9］。不同濃度心竇房結(jié)細胞裂解液與大鼠BMSCs共培養(yǎng)，能夠誘導BMSCs向心肌樣細胞分化，且分化后的細胞具有起搏功能［10］。

2 細胞共培養(yǎng)在體外細胞組織重建的應用

2.1 在角膜細胞組織體外重建的應用

合適的種子細胞是組織工程眼表重建技術(shù)的關(guān)鍵之一。建立眶周脂肪干細胞(orbital fat-derived stem cells，OFSCs)與人角膜上皮細胞(human corneal epithelial cells，HCE-T)直接混合和非直接接觸兩種二維共培養(yǎng)體系，HCE-T細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)OFSCs設(shè)為對照，發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)組可檢測到部分OFSCs表達CK19及CK3，而在非直接接觸共培養(yǎng)組及對照組檢測不到，表明OFSCs可分化為角膜上皮細胞，直接接觸是其分化的必要條件，顯示了其在細胞治療由角膜上皮細胞丟失引起的角膜疾病的潛在臨床應用［11］。

2.2 在牙周細胞組織研究的應用

BMSCs與牙周韌帶細胞混合共培養(yǎng)后骨鈣蛋白和骨橋蛋白表達顯著增加，骨唾液酸糖蛋白表達明顯下調(diào)，表明兩種細胞直接接觸及牙周韌帶細胞分泌的一些因子可誘導BMSCs獲得牙周韌帶樣的特性，提示BMSCs應用于牙周組織再生和修復的可能［12］。

2.3 在心血管系統(tǒng)的應用

將人臍靜脈內(nèi)皮細胞與BMSCs進行非直接接觸共培養(yǎng)，BMSCs可被誘導為內(nèi)皮樣細胞，誘導后的細胞從形態(tài)到表型特征都與成熟內(nèi)皮細胞相似，傳代擴增迅速并能夠在脫細胞牛頸靜脈血管支架上黏附生長，為BMSCs用于人工血管或瓣膜的細胞種植提供了一種新的途徑［13］。

2.4 在軟骨細胞組織體外重建的應用

將負載軟骨細胞和負載胚芽來源細胞的水凝膠聚合進行三維共培養(yǎng)，3周后移植到無胸腺雄性裸鼠，6周后取出檢測，胚芽來源細胞能夠在體內(nèi)繼續(xù)分化，移植物中有細胞外基質(zhì)產(chǎn)生和新生軟骨形成［14］。軟骨細胞和BMSCs非接觸共培養(yǎng)能誘導BMSCs分化為較成熟的軟骨細胞并形成小的軟骨樣組織，有II型膠原的分泌，與條件培養(yǎng)基誘導的軟骨細胞相比，共培養(yǎng)誘導的軟骨細胞更有利于作為組織工程軟骨的種子細胞［15］。

2.5 在神經(jīng)細胞組織體外重建的應用

組織工程神經(jīng)作為移植的替代物，已成為神經(jīng)缺損修復的一個重要研究領(lǐng)域。經(jīng)過神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3基因修飾的血旺細胞(Schwann cells，SCs)與絡氨酸蛋白激酶C基因修飾的BMSCs共培養(yǎng)于帶有多管道的PLGA導管，可促進BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化，并有突觸樣結(jié)構(gòu)形成，人造BMSCs/SCs/PLGA復合體有望應用于脊髓損傷的治療［16］。

3 問題與展望

細胞共培養(yǎng)體系能夠增加干細胞分化的可塑性，構(gòu)建的三維模型更接近于體內(nèi)的真實環(huán)境，成為近年來組織工程研究的熱點。但共培養(yǎng)體系的建立和應用仍存在一些不足，混合共培養(yǎng)模型中兩種細胞分離較困難，不便于區(qū)別觀察和后續(xù)檢測，需結(jié)合一定的分選技術(shù)。非直接接觸共培養(yǎng)可分別觀察兩種細胞的形態(tài)變化及得到相對高純度的細胞進行功能檢測，彌補混合培養(yǎng)模式的不足，但它只能通過旁分泌的細胞因子相互作用，喪失了細胞與細胞的直接接觸作用，與體內(nèi)環(huán)境存在一定的差異，相比較而言，利用多微孔膜建立的直接接觸共培養(yǎng)更為理想，既有可溶性分泌因子的相互交流，又能形成兩側(cè)細胞胞質(zhì)間的連接，同時能限制細胞的遷移，在二維細胞培養(yǎng)中將得到更加廣泛的應用和發(fā)展。而三維細胞共培養(yǎng)同時有細胞間的直接接觸和分泌因子的流通，能夠提供細胞更充分的立體生長空間，模型更符合生理學特點，為將來細胞組織體外重建研究進一步添加神經(jīng)和血管的介入奠定了更加堅實的基礎(chǔ)。

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The application of cell co-culture in the reconstruction of cells and tissues in vitro

TAN Mei-hua1，CHEN Jian-su2*

(1.Dept．of Ophthalmology，the First Clinical Medical College of Jinan University;2.Eye Institute，Medical College of Jinan University，Guangzhou 510632，China)

Based on maintaining the fundamental structures and properties of cells，the cell co-culture system makes the environmentin vitroto be similar within vivoenvironment as far as possible through interactions of two or more kinds of cells and tissues．So the cell co-culture system makes up for the defects of monolayer cell culture and is conducive to reconstructing cells and tissuesin vitrocloser to the physiological state．The system is widely used in modern cell research，which makes it to be an important technology for the cells and tissues reconstructionin vitroof cornea，periodont，cartilage，cardiovascular，neural，et al．In the field of stem cell research，the co-culture system of direct contact through porous membrane has been paid much attention recently and three-dimensional culture will be the focal point in the future．

cell co-culture;stem cells;tissue engineering

R-331

A

1001-6325(2012)09-1111-04

2011－11－02

2011－12－28

*通信作者(corresponding author):chenjiansu2000@163．com