鄧 旺，王導(dǎo)新，鄧 嘉，朱 濤

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400010)

PI3K/Akt信號通路上調(diào)急性肺損傷大鼠肺泡上皮鈉通道表達(dá)

鄧 旺，王導(dǎo)新*，鄧 嘉，朱 濤

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400010)

目的 探討PI3K/Akt信號通路對急性肺損傷(ALI)大鼠肺泡上皮鈉通道(ENaC)α、β和γ亞基表達(dá)的影響。方法 成年SD大鼠隨機(jī)分為對照組、ALI組(脂多糖)、胰島素組及渥曼青霉素組，每組5只。觀察肺組織病理改變，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，測量總肺水含量，RT-PCR和Western blot測定ENaC mRNA和蛋白、p-Akt表達(dá)。結(jié)果 胰島素組BALF蛋白含量、髓過氧化物酶(MPO)活性、總肺水含量較ALI組顯著減少(P＜0.05)，渥曼青霉素組BALF蛋白含量、MPO活性及總肺水含量較胰島素組顯著增加(P＜0.05)。ALI組α-、β-和γ-ENaC蛋白表達(dá)顯著低于對照組(0.33±0.06 vs 1.27±0.07，0.18±0.04 vs 0.72±0.04，0.37±0.04 vs 0.69±0.05)(P＜ 0.05)。胰島素組蛋白表達(dá)α-ENaC(2.19±0.04)、β-ENaC(1.18±0.07)和γ-ENaC(1.18±0.08)顯著高于ALI組(P＜ 0.05)。渥曼青霉素組蛋白表達(dá)α-ENaC(0.86±0.09)、β-ENaC(0.58±0.05)和γ-ENaC(0.59±0.02)顯著低于胰島素組(P＜0.05)。胰島素組ENaC mRNA和p-Akt較ALI組顯著升高(P＜0.05)。渥曼青霉素組ENaC mRNA和p-Akt較胰島素組顯著降低(P＜0.05)。結(jié)論 激活PI3K/Akt通路上調(diào)3種ENaC亞基表達(dá)，從而清除肺水腫液。

急性肺損傷;肺泡上皮鈉離子通道;PI3K/Akt信號通路

急性肺損傷(actue lung injury，ALI)時肺泡上皮損傷導(dǎo)致肺泡腔內(nèi)富含蛋白的水腫液聚集，有效地清除過多的水腫液對維持正常氣體交換及預(yù)后具有重要意義［1］。同時，肺泡上皮鈉通道(epithelial sodium channel，ENaC)是清除肺泡水腫液的重要環(huán)節(jié)［2］。磷酯酰肌醇3-激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)參與細(xì)胞分化與代謝，其下游的蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通過胰島素激活PI3K而活化，是胰島素作用的重要通路［3］。PI3K/Akt信號通路是一種保護(hù)機(jī)體應(yīng)對各種應(yīng)激的重要生存通路，對肺損傷具有保護(hù)作用［4］。胰島素激活PI3K/Akt信號通路能否參與調(diào)控ENaC，并影響ALI肺泡水腫液的清除尚不清楚。本研究建立ALI大鼠模型，觀察PI3K/Akt信號通路對ENaC各亞基表達(dá)的影響，探討PI3K/Akt信號通路在ALI中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

清潔級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量(230±20)g［重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號:SCXK(渝)2007-0001］，重組人胰島素(EliLilly公司)，脂多糖(LPS，E．coli，O111:B4)和渥曼青霉素(Sigma公司)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒(南京建成工程生物研究所)，總RNA提取試劑盒和RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，α-、β-、γ-ENaC 及 β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(Abcam公司)，Akt抗體及磷酸化Akt(p-Akt)(Ser473)抗體(Cell Signaling公司)。

1.2 動物模型、分組及血糖監(jiān)測

給大鼠腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉，用微量泵從左側(cè)頸靜泵入藥物。大鼠隨機(jī)分為對照組，僅泵入等量的0.9%氯化鈉注射液;ALI組，腹腔注射脂多糖(LPS，5.0 mg/kg)建立ALI模型;胰島素組(LPS+胰島素)，持續(xù)泵入胰島素0.1 U/(kg·h);渥曼青霉素組(LPS+胰島素+渥曼青霉素)，在持續(xù)泵入胰島素0.1 U/(kg·h)的同時，分別于LPS注射前90 min，注射后90及360 min 3次靜脈給渥曼青霉素(0.06 mg/kg)。每組大鼠5只。各組藥物作用8 h后處死大鼠，收集標(biāo)本及監(jiān)測不同時間點(diǎn)大鼠血糖水平。

1.3 病理檢查

取右下肺葉組織，常規(guī)HE染色，觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.4 總肺水含量(total lung water content，TLW)測定

取右肺上葉，稱濕重。然后置于80℃烤箱中烘烤48 h，再稱重。根據(jù)公式計算:TLW=(濕重－干重)/干重［5］。

1.5 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)收集

結(jié)扎右肺門，常規(guī)收集BALF，儲存－80℃以備檢測蛋白濃度和MPO活性。BALF中的蛋白濃度測定采用BCA法(bicinchoninic acid)。

1.6 RT-PCR

用總RNA提取試劑盒提取肺組織總RNA。PCR引物序列:α-ENaC(509 bp)上游引物:5'-TACC CTTCCAAGTATACACAGC-3'，下游引物:5'-CAGAA GGAGACTCCGAATTAGT-3';β-ENaC(406 bp)上游引物:5'-GCTAAAGAGCTAGCAGTAATGG-3'，下游引物:5'-CTGGTGTTTGTTATGCCTAGAG-3';γ-ENaC(363 bp)上游引物:5'-GGATCCTGAGAGAGAATC ATGC-3'，下游引物:5'-GTGTCCAGCTATGCCCTTT AAC-3';β-actin(871 bp)上游引物:5'-GTACAACCT TCTTGCAGCTCCT-3'，下游引物:5'-ACAGGATTCCA TACCCAGGAAG-3'。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃1 min，變性94 ℃ 30 s，退火53 ℃(α-ENaC)、53 ℃(β-ENaC)、55 ℃ (γ-ENaC)和55 ℃ (β-actin)30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物8 μL與上樣緩沖液混勻，1.2%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像，Quantity One軟件分析條帶密度，以目的條帶與β-actin比值作為結(jié)果。

1.7 Western blot檢測ENaC蛋白的表達(dá)

提取肺組織蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，－80℃保存。蛋白樣品經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入抗體 α-ENaC(1∶300)、β-ENaC(1∶1 000)、γ-ENaC(1∶1 000)、p-AK(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)4 ℃孵育過夜。洗膜 3遍，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1.5 h，ECL顯色。凝膠成像，Quantity One軟件分析條帶吸光度值，以目的條帶與β-actin比值作為結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析(ANOVA)或者Student's-t檢驗，運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析處理。

2 結(jié)果

2.1 不同時間點(diǎn)的血糖水平

胰島素0.1 U/(kg·h)對大鼠血糖無顯著影響，血糖維持在4.7～5.2 mmol/L之間。在0、1、4和8 h，胰島素0.1 U/(kg·h)和渥曼青霉素(0.06 mg/kg)干預(yù)，對ALI大鼠血糖也無顯著影響。

2.2 肺組織病理變化

對照組(圖1A)肺組織未見肺泡及間質(zhì)明顯水腫和炎性細(xì)胞浸潤，未見透明膜形成。ALI組可見肺泡及間質(zhì)水腫，出血明顯，炎性細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)可見透明膜形成(圖1B)。胰島素治療后，顯著減輕肺泡及間質(zhì)水腫，出血減輕，少量炎性細(xì)胞浸潤(圖1C)。渥曼青霉素干預(yù)后，可見肺泡及間質(zhì)水腫，出血明顯，炎性細(xì)胞浸潤增加，肺泡腔內(nèi)透明膜形成(圖1D)。

2.3 TLW及BALF中蛋白含量和MPO活性變化

與對照組比較，ALI組 TLW明顯增加(P＜0.05)，蛋白含量和MPO活性顯著增加(P＜0.05)。與ALI組比較，胰島素組 TLW明顯減少(P＜0.05)，蛋白含量和MPO活性顯著降低(P＜0.05)。與胰島素組比較，渥曼青霉素干預(yù)后TLW顯著增加(P＜0.05)，蛋白含量和MPO活性顯著增加(P＜0.05)(表1)。

表1 TLW和BALF中蛋白含量及MPO活性Table 1 TLW and total protein and MPO activity in BALF(±s，n=5)

表1 TLW和BALF中蛋白含量及MPO活性Table 1 TLW and total protein and MPO activity in BALF(±s，n=5)

*P＜0.05 compared with control group;#P＜0.05 compared with ALI group;ΔP ＜0.05 compared with Insulin group．

group TLW(g/g) total protein(g/L)MPO activity(U/L)control 1.65±0.42 1.32±0.24 1.16±0.52 ALI 7.39±1.01* 8.54±0.66* 8.86±1.69*insulin 3.02±0.78# 4.83±0.55# 4.21±0.75#wortmannin 5.71±0.99Δ 6.89±0.29Δ 6.61±0.92Δ

2.4 肺組織ENaC mRNA的表達(dá)

ALI組 α-、β-、γ-ENaCmRNA 表達(dá)比對照組顯著降低(P＜0.05)。與ALI組比較，胰島素組α-、β-、γ-ENaCmRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。渥曼青霉素干預(yù)后 α-、β-、γ-ENaCmRNA 表達(dá)較胰島素組顯著降低(P＜0.05)(圖2，表2)。

圖1 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變Fig 1 Histology changes of rat lung(×100)

圖2 ENaC mRNA的表達(dá)Fig 2 Expression of ENaC mRNA

表2 ENaC mRNA的表達(dá)Table 2 Expression of ENaC mRNA(±s，n=5)

表2 ENaC mRNA的表達(dá)Table 2 Expression of ENaC mRNA(±s，n=5)

*P＜0.05 compared with control group;#P＜0.05 compared with ALI group;ΔP ＜0.05 compared with insulin group．

-ENaC control 0.694±0.054 0.354±0.043 0.226±0.031 group α-ENaC β-ENaC γ ALI 0.152±0.037* 0.148±0.036* 0.122±0.035*insulin 1.164±0.099# 0.602±0.081# 0.440±0.064#wortmannin 0.438±0.075Δ 0.264±0.050Δ 0.168±0.024Δ

2.5 肺組織ENaC蛋白的表達(dá)

ALI組 α-、β-、γ-ENaC 蛋白表達(dá)較對照組顯著降低(P＜0.05)。與 ALI組比較，胰島素組 α-、β-、γ-ENaC蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。渥曼青霉素干預(yù)后α-、β-、γ-ENaC蛋白表達(dá)較胰島素組顯著降低(P＜0.05)(圖3，表3)。

2.6 肺組織p-Akt的活化

ALI組中p-Akt表達(dá)較對照組明顯減少(P＜0.05)。與ALI組比較，胰島素組p-Akt表達(dá)明顯提高(P＜0.05)。渥曼青霉素干預(yù)后p-Akt表達(dá)較胰島素組明顯減少(P＜0.05)(圖4，表3)。

3 討論

肺泡腔內(nèi)過多的富含蛋白的水腫液聚集導(dǎo)致氧合功能障礙是ALI發(fā)生的重要病理生理特征，因此，有效地清除過多的水腫液，維持肺泡腔干燥，能降低ALI的死亡率［6］。最近研究表明在維持正常血糖情況下，外源性胰島素治療能減輕 ALI的肺損傷［7］。本研究持續(xù)泵入的胰島素劑量維持了大鼠血糖在正常范圍內(nèi)，沒有引起ALI大鼠血糖的顯著變化。

表3 肺組織ENaC及p-Akt蛋白的表達(dá)Table 3 Expression of ENaC protein and p-Akt in lung tissue(±s，n=5)

表3 肺組織ENaC及p-Akt蛋白的表達(dá)Table 3 Expression of ENaC protein and p-Akt in lung tissue(±s，n=5)

*P＜0.05 compared with control group;#P＜0.05 compared with ALI group;ΔP ＜0.05 compared with insulin group．

-ENaC p-Akt control 1.27±0.07 0.72±0.04 0.69±0.05 0.37±group α-ENaC β-ENaC γ 0.05 ALI 0.33±0.06* 0.18±0.04* 0.37±0.04* 0.18±0.03*insulin 2.19±0.04# 1.18±0.07# 1.18±0.08# 1.17±0.07#wortmannin 0.86±0.09Δ 0.58±0.05Δ 0.59±0.02Δ 0.24±0.04Δ

腹腔注入LPS后能激活腹腔巨噬細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞，產(chǎn)生炎性反應(yīng)介質(zhì)，吸收入血后使中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞聚集在肺毛細(xì)血管處，釋放活性氧，引起肺泡毛細(xì)血管屏障滲漏，導(dǎo)致間質(zhì)及肺泡水腫［8］。MPO 作為反應(yīng)中性粒細(xì)胞活性的指標(biāo)［9］。結(jié)果顯示胰島素治療能有效減輕ALI的TLW、BALF的蛋白滲出及 MPO活性和肺損傷程度，肺組織p-Akt表達(dá)也顯著增加。用渥曼青霉素(抑制PI3K/Akt通路［10］)干預(yù)后，明顯抑制了胰島素引起的保護(hù)效應(yīng)，肺組織中p-Akt表達(dá)也減少。提示，激活PI3K/Akt通路減少了肺水腫液及蛋白滲出，減輕了肺損傷，保護(hù)了肺組織。

ENaC由 α、β 和 γ 3個亞基組成。α-、β-和γ-ENaC是肺水腫液清除必不可少的［11］。研究顯示胰島素調(diào)控ENaC的表達(dá)需要PI3K的參與，但其具體信號通路尚未闡明［12］。本實驗顯示胰島素治療能顯著上調(diào) ALI引起的 α-、β-和 γ-ENaC mRNA 及蛋白表達(dá)的下降，p-Akt表達(dá)增加。渥曼青霉素干預(yù)后，α-、β-和γ-ENaC mRNA 及蛋白的表達(dá)顯著下降，p-Akt表達(dá)減少。說明激活PI3K/Akt信號通路能上調(diào) α-、β-和 γ-ENaC 的表達(dá)，阻斷 PI3K/Akt信號通路則下調(diào)α-、β-和γ-ENaC的表達(dá)。本結(jié)果也顯示α-、β-和γ-ENaC表達(dá)上調(diào)使肺水腫液含量及BALF蛋白滲出減少，進(jìn)一步證明了激活PI3K/Akt信號通路上調(diào)ENaC的表達(dá)，從而對過多的蛋白水腫液清除的作用。

綜上所述，激活 PI3K/Akt信號通路能上調(diào)ENaC的表達(dá)，清除ALI時肺內(nèi)多余的水腫液，從而減輕肺組織損傷。

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PI3K/Akt signaling pathway up-regulates the expression of alveolar epithelial sodium channel in acute lung injury rats

DENG Wang，WANG Dao-xin*，DENG Jia，ZHU Tao

(Dept．of Respiratory Medicine，the Second Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China)

ObjectiveTo investigate the role of PI3K/Akt signaling pathway on expression of alveolar epithelial sodium channel(ENaC)α，β and γ subunits in LPS-induced acute lung injury(ALI)．MethodsAdult SD rats were randomly divided into control group，ALI group，insulin group and wortmannin group with 5 rats in each．The pathological changes in lung，total lung water content(TLW)，bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were analyzed and the mRNA and protein level of ENaC and level of p-Akt were determined by RT-PCRand Western blot．ResultsProtein level and MPO activity in BALF and TLW in insulin group were significantly lower than that in ALI group(P＜0.05);Protein level and MPO activity in BALF and TLW in wortmannin group were significantly higher than that in insulin group(P ＜ 0.05)．Protein levels of α-，β-and γ-ENaC in ALI group were significantly lower than that of control group(0.33±0.06 vs 1.27±0.07，0.18±0.04 vs 0.72±0.04，0.37±0.04 vs 0.69±0.05)(P＜0.05)．Protein levels of α -ENaC(2.19±0.04)，β-ENaC(1.18 ±0.07)and γ-ENaC(1.18 ±0.08)in insulin group were significantly higher than that of ALI group(P＜0.05)．Protein levels of α-ENaC(0.86 ± 0.09)，β-ENaC(0.58 ±0.05)and γ-ENaC(0.59 ±0.02)in wortmannin group were significantly lower than that of insulin group(P＜0.05)．The mRNA level of ENaC and p-Akt in insulin group were significantly higher than that of ALI group(P＜0.05);The mRNA level of ENaC and p-Akt in wortmannin group were significantly lower than that of insulin group(P＜0.05)．ConclusionsActivation of PI3K/Akt signaling pathway up-regulates the expression of α-，β-and γ-ENaC to eliminate the pulmonary edema fluid．

actue lung injury;epithelial sodium channel;PI3K/Akt signaling pathway

R 563.8

A

1001-6325(2012)09-1004-05

2011－11－10

2011－12－28

國家自然科學(xué)基金(30971303)

*通信作者(corresponding author):wangdaoxin1@163．com