張 波，孫善全，甘勝偉，鐘小燕，伍修宇，徐 進，黃 娟

(重慶醫(yī)科大學神經(jīng)科學研究中心，重慶400016)

大鼠腦出血后V1αR和AQP4表達升高與腦水腫的形成相關

張 波，孫善全*，甘勝偉，鐘小燕，伍修宇，徐 進，黃 娟

(重慶醫(yī)科大學神經(jīng)科學研究中心，重慶400016)

目的 研究精氨酸加壓素1α受體(V1αR)和水通道蛋白4(AQP4)在SD大鼠腦出血(ICH)腦組織中的表達變化及兩者在腦水腫形成中的作用。方法 將自體血注入大鼠尾狀核建立腦出血模型，分別于術后6、12、24和48 h運用干濕重法、免疫熒光和Western blot檢測腦含水量(BWC)、V1αR和AQP4蛋白的表達。結果 腦出血后6 h，V1αR和AQP4的表達開始增加，至48 h達到高峰，分別為21.88±0.44和23.16±0.67，顯著高于假手術組(14.32±0.55和13.90±0.40)，與腦含水量呈正相關(P＜0.05)。結論 V1αR介導的AQP4表達升高是腦出血后腦水腫形成的主要原因。

精氨酸加壓素;V1α受體;水通道蛋白4;腦水腫

精氨酸加壓素 (arginine-vasopressin，AVP)是一種可以維持水及電解質(zhì)平衡的神經(jīng)內(nèi)分泌肽，主要由視上核和室旁核分泌［1］。研究發(fā)現(xiàn)，AVP可在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦外傷和腦缺血的情況下促進腦水腫的形成［2－3］。AVP的這種作用可能是與其受體V1αR結合后，通過調(diào)節(jié)水通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)所介導的水分子轉運而實現(xiàn)的。本實驗研究腦出血后V1αR和AQP4在腦組織的表達規(guī)律，以明確二者在出血性腦水腫形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:清潔級雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量200～250 g，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供，許可證號:SCXK(渝)2007-0001。

1.1.2 主要試劑和藥物:小鼠抗大鼠AQP4單克隆抗體和兔抗大鼠V1αR多克隆抗體(Santa Cruz公司)，F(xiàn)ITC標記山羊抗小鼠IgG和TRITC標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)，HRP標記山羊抗小鼠IgG和HRP標記山羊抗兔IgG(Canspec公司)，Western及IP細胞裂解液(碧云天生物技術研究所)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理:動物隨機分為自體血腦出血模型組和假手術組，兩組再根據(jù)時間不同分為6、12、24和48 h組。腦出血組和假手術組每一時間點，分別進行腦含水量(brain water content，BWC)、免疫熒光和 Western blot檢測。根據(jù) Rynkowski等［4］的方法建立自體血腦出血動物模型，假手術組除不注射自體血外，其余操作同手術組。

1.2.2 干濕重法:檢測BWC。

1.2.3 免疫熒光:常規(guī)灌注取出腦組織，－20℃低溫切片機冠狀面切片，片厚6 μm，裱片于APES處理過的玻片上。10%馬血清封閉2 h，加 AQP4(1∶100)和 V1αR(1∶100)，4 ℃ 過 夜;加 FITC(1∶100)和 TRITC(1∶100)，50% 甘油封片，激光共聚焦掃描成像。使用Image-pro plus軟件進行熒光強度值的分析。

1.2.4 Western blot:迅速取出患側大腦，裂解液提取蛋白;BCA法測定蛋白濃度，10%Tris-Glycine SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉將蛋白條帶轉移至PVDF膜上，Western blot封閉液室溫封閉1 h;加小鼠抗大鼠 AQP4(1∶800)和兔抗大鼠 V1αR(1∶500)，4 ℃ 過夜;加HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)和山羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫孵育2 h;DAB顯色。使用Quantity One軟件進行半定量分析，結果以目的蛋白和β-actin吸光度的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用SPSS統(tǒng)計軟件進行兩獨立樣本的t檢驗和相關性分析。

2 結果

2.1 BWC的測定

腦出血組的BWC隨著出血時間的延長而逐漸加重，至24～48 h時最明顯，顯著高于假手術組(P＜0.05)(表1)。

表1 大鼠腦出血后不同時間點腦含水量的變化Table 1 Changes of the BWC at the different times after ICH in rats(±s，%，n=5)

表1 大鼠腦出血后不同時間點腦含水量的變化Table 1 Changes of the BWC at the different times after ICH in rats(±s，%，n=5)

＊P ＜0.05 compared with sham group．

time(hours)sham group ICH group 6 77.32±0.73 79.09±0.34*12 76.99±0.42 80.59±0.74*24 77.38±0.83 82.41±0.39*48 77.68±0.78 83.65±0.51*

2.2 免疫熒光結果

在腦出血組，V1αR和AQP4共表達于軟腦膜、脈絡叢和血腫周圍等處，尤其是24～48 h，兩者在上述區(qū)域的表達明顯增多;假手術組可見V1αR和AQP4在脈絡叢有少量的表達，而在腦室周圍未見表達。在6 h及其以后各時間點，V1αR和AQP4的表達量顯著升高(P＜0.05)，F(xiàn)ITC標記 AQP4，TRITC標記 V1αR(圖 1，表 2)。

2.3 Western blot檢測結果

在6 h及以后各時間點，V1αR和AQP4的表達量顯著高于假手術組(P＜0.05)(圖2，表3)。

2.4 V1αR和AQP4的表達及其與BWC的相關性分析

V1αR和AQP4在免疫熒光和Western blot的表達呈正相關(P＜0.05)，并與BWC呈正相關(P＜0.05)。

圖1 大鼠腦出血后24 h V1αR和AQP4蛋白在脈絡叢的共表達Fig 1 V1αR and AQP4 are co-expressed in the choroids plexus at 24 hours after ICH in rats(×800)

表2 大鼠腦出血后V1αR和AQP4在免疫熒光的表達變化Table 2 Changes of the V1αR and AQP4 expression in the immunofluorescence after ICH in rats(±s，n=5)

表2 大鼠腦出血后V1αR和AQP4在免疫熒光的表達變化Table 2 Changes of the V1αR and AQP4 expression in the immunofluorescence after ICH in rats(±s，n=5)

＊P ＜0.05 compared with sham group．

time(hours)sham group AQP4 6 ICH group V1αR AQP4 V1αR 14.19±0.41 13.95±0.39 17.37±0.64* 16.20±0.45*12 14.02±0.23 13.77±0.43 19.08±0.47* 19.67±0.32*24 14.06±0.29 13.91±0.44 22.22±0.46* 22.91±0.73*48 14.32±0.55 13.90±0.40 21.88±0.44* 23.16±0.67*

圖2 Western blot檢測大鼠腦出血后V1αR和AQP4蛋白的表達Fig 2 V1αR and AQP4 expression by Western blot after ICH in rats

3 討論

AQP4是一種可介導細胞水分子轉運的膜蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要位于星形膠質(zhì)細胞的終足膜，對于腦組織內(nèi)的水鹽代謝具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)［5－7］，AQP4基因敲除的大鼠在由低鈉血癥、細菌性腦膜炎和腦缺血等所引起的細胞毒性腦水腫明顯減輕;在腦腫瘤的模型中，AQP4基因敲除大鼠的神經(jīng)缺失癥狀和顱內(nèi)高壓都較野生型大鼠為輕［8］。表明AQP4在腦水腫形成中具有重要作用。目前對AQP4表達調(diào)控機制的研究尚不充分。

表3 大鼠腦出血后V1αR和AQP4蛋白的表達Table 3 Western blot analysis of V1αR and AQP4 expression after ICH in rats(±s，n=5)

表3 大鼠腦出血后V1αR和AQP4蛋白的表達Table 3 Western blot analysis of V1αR and AQP4 expression after ICH in rats(±s，n=5)

＊P ＜0.05 compared with sham group．

time(hours)sham group AQP4 6 ICH group V1αR AQP4 V1αR 0.30±0.017 0.39±0.007 0.67±0.027* 0.61±0.015*12 0.29±0.011 0.37±0.017 0.73±0.025* 0.74±0.016*24 0.30±0.027 0.37±0.005 0.82±0.016* 0.84±0.021*48 0.30±0.013 0.39±0.023 0.84±0.021* 0.87±0.035*

AVP在體內(nèi)主要由視上核和室旁核分泌，可調(diào)節(jié)體內(nèi)水的重吸收和促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocortico-tropic-hormone，ACTH)的釋放，對于維持機體的內(nèi)環(huán)境平衡有著重要作用。在體內(nèi)AVP主要通過與其受體(VR)的結合而發(fā)揮作用，AVP的受體主要包括 V1和 V2。V1又分為 V1αR 和 V1βR，其中V1αR主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是額顳葉的星形膠質(zhì)細胞［9］;而V1βR則主要分布于垂體，可調(diào)節(jié)ACTH的釋放。V2主要分布于腎臟的遠曲小管和集合管處，調(diào)節(jié)AQP2在腎臟內(nèi)對水的重吸收［10］。在腦外傷后，腦組織中AVP和V1αR的濃度同時升高，AVP和V1αR的表達上調(diào)在外傷性腦水腫的形成中具有重要作用［11］。有關 AVP和V1αR在腦出血后的表達變化及其相關性尚未見報道。

本研究結果顯示，在腦出血后6 h，可見V1αR和AQP4表達開始升高。二者的表達呈正相關，并與BWC呈正相關。提示AVP在出血性腦水腫形成中的作用是通過與V1αR的結合，導致細胞內(nèi)的磷脂酶C(PLC)升高，繼而引起二酰甘油(DAG)和肌醇1，4，5-三磷酸(InsP3)升高，而后者的升高引起細胞內(nèi)Ca2+的升高，升高的Ca2+與DAG共同激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，PKC可通過 Ser180位點的磷酸化而引起AQP4的表達上調(diào)［12］，而后者的表達上調(diào)可介導星形膠質(zhì)細胞對水通透性的增加，導致細胞外的水分向細胞內(nèi)轉運，從而引起腦水腫。

綜上所述，腦出血后AQP4的異常升高是引起腦水腫的主要原因之一，而AQP4的升高主要由于V1αR的調(diào)節(jié)所導致。提示在臨床出血性腦水腫的治療過程中，可將V1αR作為治療靶點，抑制V1αR的表達，以降低AQP4的表達，從而減輕腦水腫。

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Increased expression of V1αreceptor and AQP4 are related to rat brain edema after intracerebral hemorrhage

ZHANG Bo，SUN Shan-quan*，GAN Sheng-wei，ZHONG Xiao-yan，WU Xiu-yu，XU Jin，HUANG Juan

(Institute of Neuroscience，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

ObjectiveTo investigate the change of arginine-vasopressin V1αreceptor(V1αR)and aquaporin 4(AQP4)expression，to explore the mechanism of brain edema caused by intracerebral hemorrhage(ICH)．MethodsAutologous blood were injected into the caudate nucleus to develope ICH model．The changes of brain water content(BWC)were measured by wet and dry weight methods．The expression of V1αR and AQP4 were detected by immunofluorescence and Western blot after 6，12，24 and 48 h．ResultsThe expression of V1αR and AQP4 increased at 6h after ICH，and significantly increased the peak at 48 h(21.88±0.44 and 23.16±0.67)than the sham group(14.32±0.55 and 13.90 ±0.40)．V1αR and AQP4 expressions positively correlated with BWC(P ＜0.05)．ConclusionsThe increased expression of AQP4 mediated by V1αR plays an important role in the brain edema after ICH．

arginine-vasopressin;V1αreceptor;aquaporin 4;brain edema

R 741.02

A

1001-6325(2012)09-1021-05

2011－09－15

2011－12－29

國家自然科學基金(30470608)

*通信作者(corresponding author):sunsq2151@sohu．com