李敏娜，申 樂，黃宇光

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京100730)

慢性神經(jīng)病理性疼痛對(duì)大鼠脊髓背角miRNA表達(dá)的影響

李敏娜，申 樂，黃宇光*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京100730)

目的 篩選慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角差異表達(dá)的miRNA，并預(yù)測(cè)其調(diào)控的靶基因。方法 建立大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷CCI模型，在術(shù)后疼痛高峰期取腰膨大脊髓背角，用miRNA芯片篩選CCI大鼠差異表達(dá)的miRNAs，再用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNAs，并利用MIRANDA、TARGETSCAN、PICTAR 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)找出這些miRNA可能調(diào)控的靶基因。結(jié)果 CCI大鼠表達(dá)上調(diào)的有miR-99b，表達(dá)下調(diào)的有miR-674-3p、miR-879與miR-325-5p。RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片基本相符。預(yù)測(cè)這些miRNA可能的靶基因約26個(gè)，這些基因功能廣泛。結(jié)論 慢性神經(jīng)病理性疼痛可導(dǎo)致miRNA的表達(dá)發(fā)生變化，這些miRNA及其調(diào)控的靶基因?yàn)檫M(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

慢性疼痛;微小RNA;芯片;熒光實(shí)時(shí)定量PCR;脊髓背角

微小RNA(microRNA，miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，約18～25個(gè)核苷酸，可通過堿基配對(duì)與mRNA分子相結(jié)合來直接降解mRNA或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平使基因沉默［1-2］。miRNA參與早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡和細(xì)胞分化等重要生命進(jìn)程［3］。miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)的分化、發(fā)育、決定細(xì)胞命運(yùn)方面有重要作用。miRNA可在突觸部位選擇性聚集或缺失，調(diào)節(jié)突觸局部的基因表達(dá)和蛋白合成，影響神經(jīng)細(xì)胞的突觸可塑性［4］。有研究者發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)疼痛小鼠神經(jīng)系統(tǒng)miRNA表達(dá)水平發(fā)生變化，推測(cè)在疼痛的發(fā)生機(jī)制中miRNA可能發(fā)揮了重要作用［5-6］。本研究旨在通過miRNA芯片和實(shí)時(shí)定量PCR篩選發(fā)現(xiàn)慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角組織中差異表達(dá)的miRNA，分析其對(duì)慢性疼痛相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)可能產(chǎn)生的影響，以初步探索miRNA在慢性疼痛的分子生物學(xué)機(jī)制中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 CCI大鼠模型的建立

24只SPF級(jí)SD雄性大鼠［北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，經(jīng)營(yíng)許可證編號(hào):SCXK(京)20022003］，體質(zhì)量 180～200 g，隨機(jī)均分為對(duì)照(control)組、假手術(shù)(sham)組和慢性神經(jīng)病理性疼痛(CCI)組。按文獻(xiàn)［7］的方法制作坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(chronic constrictive injury，CCI)模型，在坐骨神經(jīng)分成三支前的主干部位距神經(jīng)起始處上方2 mm用4-0羊腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)4道，每道間隔約1 mm，結(jié)扎的松緊度以打結(jié)時(shí)可見肌肉輕微抽動(dòng)為準(zhǔn)。以電子Von Frey刺激針(NC 12775-99 Touch Test Evaluator Set 20，North Coast公司)刺激大鼠足底，大鼠會(huì)出現(xiàn)抬足、縮足、快速甩足以及甩足后舔足等反應(yīng)，每只大鼠刺激3次，間隔大于10 s，將3次平均值作為機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。將RCY-2熱板測(cè)痛儀(上海市益聯(lián)科技設(shè)備有限公司)水浴箱預(yù)熱至52±0.3℃，測(cè)量大鼠從后足接觸熱板起到發(fā)生縮足反射潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)。測(cè)量3次取平均值，作為熱刺激傷害感受閾。于術(shù)前及術(shù)后第3、5和7天測(cè)量機(jī)械縮足反射閾值及熱刺激傷害感受閾值。術(shù)后7 d取大鼠腰膨大手術(shù)側(cè)脊髓背角，立即放入液氮冷卻5～10 min后放入-80℃冰箱保存。

1.2 RNA提取

根據(jù)Invitrogen公司說明書，用Trizol法提取組織RNA，紫外分光光度儀定量后，用2%瓊脂糖電泳鑒定RNA質(zhì)量。

1.3 miRNA芯片篩選

CCI組、sham組和control組中各隨機(jī)選取3個(gè)樣本進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)(n=3)。選用Exiqon microRNA芯片V11.0版本(上海康成生物技術(shù)有限公司)，包含所有物種 miRNA 6396個(gè)探針。先用 miRCURYTM Array Labelling kit(Exiqon公司，cat 208032)標(biāo)記miRNA，用 RNeasy Mini Kit(Qiagen公司，cat 74104)濃縮標(biāo)記樣本，再將miRNA芯片雜交。應(yīng)用Genepix 4000B進(jìn)行圖像掃描，用635 nm激發(fā)，用Genepix Pro 6.0分析數(shù)據(jù)。

1.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果

根據(jù)文獻(xiàn)［8］的Stem-loop法進(jìn)行miRNA的反轉(zhuǎn)錄-熒光實(shí)時(shí)定量PCR。相應(yīng)的引物見表1。按照PrimeScriptTM RTreagentkit(Takara公司DRR037A)，42 ℃ 15 min反轉(zhuǎn)錄，85 ℃ 15 s終止反應(yīng)，冰上冷卻，合成cDNA第一鏈。根據(jù)Takara公司說明書配制20 μL/體系，各樣品對(duì)應(yīng)miRNA和U6內(nèi)參兩組，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)平行孔，PCR反應(yīng)在ABI 7500儀器進(jìn)行。

1.5 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用 miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件 Pictar、Targetscan、MiRbase、MiRanda 在線服務(wù)站點(diǎn)，輸出差異表達(dá)miRNA的預(yù)測(cè)靶基因，取至少3個(gè)軟件預(yù)測(cè)到的基因作為靶基因。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料經(jīng)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組樣本均數(shù)間的比較用t檢驗(yàn)，多組樣本間均數(shù)的比較用方差齊性檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 CCI成功建模

CCI大鼠術(shù)后3～5d，手術(shù)側(cè)足趾并攏輕度外翻，行走無力，步態(tài)跛行，經(jīng)常左后足懸空或不敢著地;站立時(shí)以右后肢持重，左后肢抬起并緊貼于腹部，CCI大鼠無發(fā)生自噬肢體現(xiàn)象。CCI組大鼠術(shù)后第3天手術(shù)側(cè)機(jī)械性痛閾明顯低于非手術(shù)側(cè)，也明顯低于sham組和control組，第7天達(dá)到最低值(圖1)。CCI組大鼠自術(shù)后第3天患足熱痛敏閾值顯著下降，與術(shù)前基礎(chǔ)值和sham組及control組相比有顯著性差異(圖2)。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequence for real time PCR

圖1 CCI大鼠術(shù)后機(jī)械性痛閾值變化Fig 1 Change of the MWT of CCI rats after operation(n=8)

2.2 總RNA質(zhì)量鑒定

提取各組大鼠脊髓背角總RNA，測(cè)A260/A280，均為1.8～2.1，行瓊脂糖凝膠電泳顯示28S和18S條帶清晰，28S的亮度大約是18S亮度的兩倍(圖3)，說明提取的總RNA完整，質(zhì)量較好，可用于芯片實(shí)驗(yàn)以及熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR。

2.3 miRNA芯片篩選

分別將CCI、sham和control組(n=3)大鼠脊髓背角提取的RNA經(jīng)過標(biāo)記，雜交，再掃描將圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，用配套軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析運(yùn)算。

根據(jù)芯片結(jié)果比較分析CCI與sham、control組差異表達(dá)的miRNA，共同上調(diào)的有miR-99b，共同下調(diào)的有 miR-325-5p、miR-674-3p、miR-879(變化倍數(shù)＞1.5或 ＜0.6，均P＜0.05)(表2)。

表2 CCI大鼠差異表達(dá)的miRNAsTable 2 Differently expressed miRNAs of CCI rats(n=3)

2.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果

miRNA的real-time RT-PCR產(chǎn)物約65 bp，U6的產(chǎn)物約90 bp(圖4)。熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致，其中miR-99b、miR-674-3p、miR-879 CCI組與sham組和control組有顯著性差異，表明本實(shí)驗(yàn)的miRNA芯片結(jié)果基本可靠(圖5)。

圖4 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR產(chǎn)物電泳Fig 4 Electrophoresis of real time RT-PCR products

2.5 靶基因預(yù)測(cè)

4個(gè)miRNA共找到潛在的靶基因26個(gè)(表3)，這些基因功能廣泛，涉及信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、細(xì)胞骨架、細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及能量代謝等各個(gè)方面。

3 討論

圖5 Real-time PCR驗(yàn)證CCI大鼠差異表達(dá)的miRNAsFig 5 Real-time PCR test and verify the differently expressed miRNAs of CCI rats(n=8)

表3 預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶基因Table 3 Predict the target genes of the differently expressed miRNAs

神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制至今未明，目前仍缺乏有效的治療措施，因此進(jìn)一步探求發(fā)病機(jī)制尤為重要。許多研究發(fā)現(xiàn)miRNAs與調(diào)節(jié)生物生長(zhǎng)、發(fā)育，疾病發(fā)生過程密切相關(guān)［3］。miRNA可以調(diào)節(jié)突觸局部的基因表達(dá)和蛋白合成，影響神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性［4］，炎性疼痛模型小鼠前額葉皮質(zhì)miRNA表達(dá)水平發(fā)生顯著變化［5］，背根神經(jīng)節(jié)miR-143表達(dá)水平顯著下降［9］，提示miRNA可能成為研究疼痛機(jī)制的新領(lǐng)域。但目前神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)miRNA的研究相對(duì)很少。本研究利用miRNA芯片和real-time PCR的方法對(duì)慢性壓迫性損傷CCI大鼠脊髓背角組織miRNA的表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的有miR-99b，表達(dá)下調(diào)的有miR-325-5p、miR-674-3p、miR-879。其中miR-99b曾在大鼠和小鼠的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元克隆和測(cè)序中被發(fā)現(xiàn)［10］，并且在人胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中可能起重要作用［11］，子宮內(nèi)膜異位癥組織的miR-99b也表達(dá)上調(diào)［12］。miRNA的功能主要是抑制靶基因的表達(dá)，因此本研究預(yù)測(cè)了這些差異表達(dá)的4個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)的26個(gè)靶基因，這些基因功能廣泛，涉及信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及能量代謝等各個(gè)方面。這些靶基因中，LRRC4是富亮氨酸重復(fù)(leucine rich repeats，LRR)超家族的新成員，是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與軸突生長(zhǎng)的功能基因，能夠下調(diào)一系列神經(jīng)生長(zhǎng)因子或受體的表達(dá)，可以調(diào)控多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)突觸發(fā)育的各個(gè)方面，包括軸突-樹突聯(lián)系的建立、早期突觸形成和突觸成熟［13］。

綜上所述，本研究首次以miRNA芯片技術(shù)對(duì)慢性神經(jīng)病理性疼痛的表達(dá)譜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)CCI大鼠脊髓背角miRNA表達(dá)發(fā)生變化，預(yù)測(cè)這些差異表達(dá)miNA的靶基因，這些miRNA及其調(diào)控的靶基因可能為今后的神經(jīng)病理性疼痛研究提供新的思路。

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Effect of chronic neuropathic pain on the expression of microRNA in the spinal dorsal horn of rats

LI Min-na，SHEN Le，HUANG Yu-guang*

(Dept.of Anesthesiology，PUMC Hospital，CAMS＆ PUMC，Beijing 100730，China)

ObjectiveTo investigate the differentially expressed miRNAs in the spinal dorsal horns of rats with chronic neuropathic pain，and predict the target genes of the miRNAs.MethodsChronic constrictive injury(CCI)rat model was established，and spinal dorsal horns were harvested when a peak pain was achieved on the 7th day post-op.Microarray analysis was applied to investigate the differentially expressed miRNAs in CCI rats，and the screened miRNAs were confirmed by real time RT-PCR.Furthermore，the possible target genes were predicted by three databases.ResultsmiRNA microarray analysis showed the expression of miR-99b as significantly up-regulated，while the expressions of miR-674-3p，miR-879 and miR-325-5p as significantly down-regulated in the spinal dorsal horns of CCI rats compared with those in the sham and control rats.The different expression profiles of the 4 miRNAs were confirmed by quantitative RT-PCR.About 26 target genes were predicted through the 3 databases based on the previous screened miRNAs.ConclusionsChronic neuropathic pain affects the expression of miRNAs.These miRNAs and target genes provide new clues for further research.

chronic pain;miRNA;microarray;real time PCR;spinal dorsal horn

R 338.3

A

1001-6325(2012)09-1044-05

2012-06-19

2012-07-02

國(guó)家自然科學(xué)基金(30872436)

*通信作者(corresponding author):pumchhyg@yahoo.com.cn