鮑曉林 郭家亮 郭玉芬

耳聾基因在遺傳性聾患者中具有較高的遺傳異質(zhì)性，在不同地區(qū)和不同人群中耳聾基因的突變頻率、突變方式和熱點(diǎn)突變有很大差異。目前普遍認(rèn)為GJB2基因、SLC26A4基因、線粒體DNA12Sr RNA是常見(jiàn)的致聾基因，也是中國(guó)耳聾人群中突變攜帶率最高的致病基因，而且不同地域、不同民族也有其自身的特點(diǎn)，但國(guó)內(nèi)相關(guān)研究絕大部分是在漢族人群中進(jìn)行的，對(duì)少數(shù)民族耳聾人群中常見(jiàn)耳聾基因的分子流行病學(xué)研究相對(duì)較少。我國(guó)是多民族的國(guó)家，隨著聾病基因篩查工作的不斷深入，越來(lái)越多的少數(shù)民族聾病資源被發(fā)現(xiàn)，為了探討不同民族聾病常見(jiàn)基因突變特點(diǎn)，了解常見(jiàn)耳聾基因突變?cè)诓煌褡彘g的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，揭示少數(shù)民族耳聾患者的遺傳學(xué)機(jī)制，制定個(gè)性化的基因篩查和聾病分子診斷流程，本研究對(duì)耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)的64例蒙古族耳聾先證者資料進(jìn)行分析，以了解蒙古族人群耳聾基因的分布特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 蒙古族非綜合征型聾患者64例，其中男34例，女30例，年齡7～21歲，中位年齡13歲，語(yǔ)前聾54例，語(yǔ)后聾6例(小于或等于2歲者判定為語(yǔ)前聾，2歲以后出現(xiàn)的聽(tīng)力下降者判定為語(yǔ)后聾)，余4例發(fā)病年齡不明確。有氨基糖苷類抗生素應(yīng)用史23例(占36.4%)，有耳聾家族史6例(9.4%)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織《障礙、殘疾和殘廢的國(guó)際分類》(1997)對(duì)語(yǔ)言頻率聽(tīng)力損失劃分標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：輕度聾(聽(tīng)力損失26～40 dB HL)、中度聾(41～60 dB HL)、重度聾(61～80 dB HL)、極重度聾(>81 dB HL)及全聾，64例中，重度聾24例，極重度聾40例。

排除標(biāo)準(zhǔn)：有典型的慢性化膿性中耳炎表現(xiàn)、聽(tīng)力檢查為傳導(dǎo)性聽(tīng)力下降或有中耳手術(shù)史，有較重的顱腦外傷或耳外傷史，綜合征型聾，中樞性疾病、腦癱等智力障礙引起的語(yǔ)言障礙患者。

1.2調(diào)查方法 對(duì)64例患者進(jìn)行全身及耳鼻咽喉科常規(guī)檢查，并進(jìn)行純音聽(tīng)閾、中耳功能ABR和耳聲發(fā)射等檢查，判斷是否存在蝸后病變。在知情同意的前提下，抽取外周靜脈血5 ml，制備基因組DNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)樣本純度，并建立耳聾基因數(shù)據(jù)庫(kù)[1,2]。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 針對(duì)GJB2基因在第二個(gè)外顯子的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[3]，引物序列為GJB2-F：GGTGTTTGCTCCAGGAAGA, GJB2-R：GGCCTACAGGGGTTTCAAAT，PCR產(chǎn)物片段大小為843 bp。用25 μl PCR反應(yīng)體系在ABI公司9700熱循環(huán)儀完成。反應(yīng)條件：10×Buffer 2.5 μl ，dNTP(2.5 mM/ul)2 μl ,20 μM/μl primers 0.5 μl ,rTag酶0.5 μl ，100 ng DNA Template 1 μl ，ddH2O 18 μl 。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后再72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序檢測(cè)突變。

針對(duì)線粒體1555位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，F(xiàn):TGCTTACCCAGACTCGAGAA，R: CGACTGAGCCTTGACAGCTGA，PCR產(chǎn)物片段大小為801 bp。PCR反應(yīng)采用25 μl 反應(yīng)體系，10×Buffer 2.5 μl ，2.5 μM dNTP2 μl ，20(M primers 0.5 μl ，rTaq酶0.5 μl ，100 ng DNA Template 1 μl ，ddH2O 18 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后再72 ℃延伸7 min，4 ℃保存，產(chǎn)物送測(cè)序檢測(cè)突變。

SCL26A4基因突變分析方法：應(yīng)用解放軍總醫(yī)院國(guó)家北方基因研究中心的20對(duì)引物序列和反應(yīng)條件[4]，分別進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，然后取PCR產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)Marker各2 μl ，分別加入6 μl 溴酚藍(lán)，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行產(chǎn)物純度和濃度的檢測(cè)，產(chǎn)物送測(cè)序檢測(cè)突變。

2 結(jié)果

GJB2基因：235delC純合突變2例(圖1)，299-300delAT和176-191del 16bp(圖2)復(fù)合雜合突變1例，235delC與176-191del 16bp復(fù)合雜合突變1例，478G>A/wt雜合突變1例，79G>A和/或341A>G遺傳多態(tài)性改變31例，占48.4%。突變率為7.81%(5/64)，等位基因攜帶率為5.46%(7/128)。

mtDNA12SrRNA 1555和1494位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)突變。

圖1 235delC突變測(cè)序圖：純合突變(中)、雜合突變(上)、正常對(duì)照(下)

圖2 299-300delAT突變測(cè)序圖：雜合突變(下)、正常對(duì)照(上)，序列方框標(biāo)識(shí)為缺失的16個(gè)堿基位置

圖3 SLC26A4基因IVS7-2A>G突變測(cè)序圖：正常對(duì)照(下)、雜合突變(上)、純合突變(中)

SLC26A4基因：919-2A>G/919-2A>G純合突變4例(圖3)；復(fù)合雜合突變4例，分別為2027 T>A/919-2A>G 2例、2169A>G/919-2A>G 2例；雜合突變7例，分別為919-2A>G/wt 4例，918+1delG/wt、1238G>A/wt和2027 T>A/wt各1例。突變率為23.44% (15/64)，等位基因攜帶頻率為17.99%(23/128)。

本組64例患者中共檢測(cè)出GJB2、SLC26A4、線粒體DNA12SrRNA三種基因突變者20例，其中SLC26A4基因突變率最高(75%，15/20)，其中919-2A

3 討論

我國(guó)地域遼闊，民族眾多，各地區(qū)經(jīng)濟(jì)和意識(shí)形態(tài)的發(fā)展極不均衡，少數(shù)民族的遺傳背景存在明顯的差異性。針對(duì)全國(guó)不同區(qū)域、不同民族的耳聾人群進(jìn)行深入的研究，掌握確鑿的聽(tīng)力學(xué)和遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，明確少數(shù)民族耳聾基因突變的頻率、特定耳聾基因突變和多態(tài)性特點(diǎn)等，能夠?yàn)槎@基因篩查和基因診斷提供詳細(xì)的參考依據(jù)，制定個(gè)性化的遺傳咨詢服務(wù)，指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育。

蒙古族主要集中聚居在內(nèi)蒙古自治區(qū)，在河北、遼寧、吉林、黑龍江以及新疆等省自治區(qū)也有蒙古族聚居區(qū)。本組64例蒙古族耳聾患者均來(lái)自在內(nèi)蒙古自治區(qū)，從病史、發(fā)病年齡、聽(tīng)力學(xué)特點(diǎn)來(lái)看無(wú)特異性。本組中蒙古族耳聾患者的三種常見(jiàn)耳聾基因突變的發(fā)生率與文獻(xiàn)報(bào)道的漢族和其他少數(shù)民族的常見(jiàn)耳聾致病基因突變頻率分布有所不同[5～8]，235delC基因突變攜帶率4.7%(3/64)，是本組中GJB2基因最多見(jiàn)的突變位點(diǎn)，占全部突變的15%(3/20)； SLC26A4基因919-2A>G是突變檢出率最高的位點(diǎn)，突變攜帶率為18.6%(12/64)，占全部突變的60%(12/20)，三種常見(jiàn)致病基因中SLC26A4基因是本組中突變率最高的，占全部突變的75%，其次為GJB2基因(25%)，而線粒體DNA 12SrRNA 1555位點(diǎn)和1494位點(diǎn)均未檢測(cè)到突變?？梢?jiàn)耳聾基因突變有明顯的種族差異，而且突變頻率有較大的地域差異[5，6]。蒙古族和漢族同屬于蒙古人種，除外種族起源和始祖效應(yīng)的因素，分析其原因還有以下幾點(diǎn)：一是本組觀察的樣本量較少，難免造成統(tǒng)計(jì)結(jié)果的偏差，還需要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行更深入的研究證實(shí)；二是本實(shí)驗(yàn)未統(tǒng)計(jì)與藥物性聾相關(guān)的961和7445等位點(diǎn)；三是由于遺傳異質(zhì)性、遺傳漂變和先證者效應(yīng)等遺傳學(xué)的不確定因素，還可能存在基因修飾或其他尚未發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)因素。由于長(zhǎng)期進(jìn)化形成各人種間的遺傳差異，人群的大規(guī)模遷移、不同種族之間的婚配、融合又使得不同種群的遺傳背景變得更為復(fù)雜，從而造成了不同地域、不同民族、不同種群之間的遺傳學(xué)特點(diǎn)各不相同。遺傳學(xué)的始祖效應(yīng)和遺傳漂變的原因使得遺傳信息發(fā)生聚集或遺傳力降低，從而出現(xiàn)了遺傳攜帶頻率的變化。蒙古族人線粒體基因研究能否成為耳聾基因研究的突破口，還需要更深入的探索，期望通過(guò)對(duì)蒙古族人的致聾基因的研究，從分子水平上認(rèn)識(shí)蒙古族人在遺傳素質(zhì)上與其他種族的不同，為更好的開(kāi)展基因診斷和治療提供指導(dǎo)。

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