鄧安春 楊仕明 黃德亮 孫建和

哺乳動(dòng)物內(nèi)耳前庭末梢感受器包括三個(gè)半規(guī)管壺腹嵴和兩個(gè)囊斑，分別感受角加速度和直線加速度，這些功能和精細(xì)三維結(jié)構(gòu)是在發(fā)育過(guò)程中不斷形成的。內(nèi)耳前庭的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，從胚胎外胚層到聽(tīng)板、聽(tīng)囊，最后發(fā)育成熟，既包括外形的初步形成和改建，又包括各種上皮細(xì)胞的定向分化等。成年小鼠內(nèi)耳感覺(jué)細(xì)胞種類、結(jié)構(gòu)、功能、位置等的多樣性決定了其離不開(kāi)多種影響因素的調(diào)控，多種基因在時(shí)間、空間上的精細(xì)、準(zhǔn)確、重疊差異表達(dá)，使很少量的相同的胚胎外胚層細(xì)胞發(fā)育形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜功能多樣的內(nèi)耳。利用基因敲除、基因打靶等分子生物學(xué)技術(shù)也證實(shí)大約有幾十種基因參與形態(tài)發(fā)育及感覺(jué)上皮定向分化的調(diào)控，但有關(guān)的詳細(xì)分子機(jī)制尚不清楚[1～3]，其中 BMP-Smad途徑被認(rèn)為是最重要的一個(gè)。一般認(rèn)為，BMP-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵事件之一，各轉(zhuǎn)錄因子正是通過(guò)調(diào)節(jié)BMP-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而參與內(nèi)耳發(fā)育的調(diào)節(jié)[4～6]。但是，BMP-Smad在內(nèi)耳前庭發(fā)育各個(gè)階段的分布、變化有待進(jìn)一步闡明。為此，本實(shí)驗(yàn)選用遺傳表型穩(wěn)定的C57BL近交系小鼠研究前庭發(fā)育過(guò)程中相關(guān)階段骨形態(tài)形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)、Smad4蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein 4)的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與標(biāo)本采集 挑選耳廓反應(yīng)靈敏、健康的2月齡C57BL/6小鼠(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，以雄：雌=1：2的比例作為種鼠，下午5點(diǎn)左右合籠，次日晨8點(diǎn)觀察母鼠陰道，若有陰栓，記為胚胎第一天(E1)，動(dòng)物統(tǒng)一編號(hào)，統(tǒng)一飼養(yǎng)。選取從胚胎第10天(E10)到胚胎第20天(E20)每天的孕鼠各兩只，動(dòng)物全部在上午8點(diǎn)處死，E10～E17時(shí)顳骨未鈣化，難以從頭顱中摘取內(nèi)耳，故留取胚胎頭，E18～E20時(shí)顳骨鈣化，胚胎頭中的顳骨脫鈣困難，導(dǎo)致切片困難，故留取胚胎內(nèi)耳。動(dòng)物的使用獲得中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的授權(quán)。

1.2主要方法與試劑

1.2.1冰凍切片 將留取的胚胎小鼠頭或胚胎小鼠內(nèi)耳固定(4%多聚甲醛+2.5%戊二醛，4℃冰箱過(guò)夜)、脫鈣(10%EDTA，4℃冰箱48小時(shí))、脫水(20%蔗糖溶液，過(guò)夜)、浸透及包埋(OCT液，過(guò)夜)，在包埋管中定位后于液氮液面冷氣急凍40秒，取出粘托，然后切片：胚胎頭平行于口-耳平面切片，內(nèi)耳平行于蝸軸切片，均連續(xù)切片，片厚6 μm。鏡下看到壺腹嵴和囊斑時(shí)，間斷取片，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2免疫組化染色及免疫熒光檢測(cè) 兔來(lái)源Smad4抗體和羊來(lái)源的BMP4抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司。免疫組化按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，大致步驟包括：冰凍切片放至室溫、60℃烤箱烤片半小時(shí)后用蒸餾水洗去OCT、高壓抗原修復(fù)3分鐘、3%H2O2室溫孵育10分鐘消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性、滴加封閉血清室溫孵育15分鐘、滴加一抗(1:100 PBS稀釋)4oC冰箱過(guò)夜、滴加生物素標(biāo)記二抗37℃孵箱40分鐘、滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15分鐘、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片后光鏡下觀察并采集圖像，分析各抗體表達(dá)的部位及強(qiáng)弱。

免疫熒光染色按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，大致步驟與免疫組化染色相同，只是二抗是熒光標(biāo)記抗體(1:50 PBS稀釋)， 37℃孵箱1小時(shí)后防淬滅封片劑封片，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。羊抗兔Alexa fluor 488熒光標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)Molecular probes公司，SP-9003免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物工程技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物工程技術(shù)有限公司。

1.2.3免疫組化及免疫熒光結(jié)果判定 在40倍的物鏡下對(duì)發(fā)育過(guò)程中前庭部分的全部區(qū)域進(jìn)行觀察，DAB染色陽(yáng)性為棕色，熒光染色陽(yáng)性為綠色熒光。記錄染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)和染色的強(qiáng)度。以陽(yáng)性細(xì)胞占觀察區(qū)域內(nèi)前庭部分全部細(xì)胞的比例分為5級(jí)計(jì)分：0為<5%；1為5%～25%；2為26%～50%；3為51%～75%；4為>75%。染色的陽(yáng)性強(qiáng)度按三級(jí)計(jì)分：1+為弱陽(yáng)性；2+為中度陽(yáng)性；3+為強(qiáng)陽(yáng)性。每例染色的陽(yáng)性細(xì)胞比例與染色強(qiáng)度相乘作為染色的加權(quán)計(jì)分值，該值>1為陽(yáng)性，<1為陰性。

2 結(jié)果

2.1BMP4在小鼠內(nèi)耳前庭發(fā)育不同階段的表達(dá) 從E10開(kāi)始，小鼠內(nèi)耳聽(tīng)囊就有BMP4的陽(yáng)性表達(dá)。E10和E11小鼠聽(tīng)囊的上皮細(xì)胞里有較強(qiáng)的BMP4表達(dá)；E12時(shí)耳周間充質(zhì)開(kāi)始濃聚，聽(tīng)囊變長(zhǎng)且可分為明顯的前庭囊和耳蝸囊兩部分，BMP4主要表達(dá)在前庭囊以及前庭囊周?chē)鷿饩鄣亩荛g充質(zhì)，這些濃聚的間充質(zhì)將形成耳軟骨囊；E13時(shí)內(nèi)耳進(jìn)一步發(fā)育，BMP4在所有已出現(xiàn)的半規(guī)管、半規(guī)管壺腹、壺腹嵴、囊及囊斑里均有陽(yáng)性表達(dá)，在軟骨囊的表達(dá)逐漸局限于半規(guī)管的背側(cè)及外側(cè)，中部前庭結(jié)構(gòu)的外側(cè)耳周間充質(zhì)；此后BMP4在小鼠內(nèi)耳的表達(dá)越來(lái)越強(qiáng)，E14時(shí)與E13的表達(dá)類似，不過(guò)在軟骨囊里的表達(dá)范圍較E13時(shí)擴(kuò)大，而且此時(shí)在耳蝸囊周?chē)能浌悄依镆灿蠦MP4的局部表達(dá)；到E15時(shí)基本與出生后的表達(dá)情況相當(dāng)，不再發(fā)生變化，軟骨囊里BMP4的表達(dá)基本勾畫(huà)出內(nèi)耳的大致形態(tài)。在感覺(jué)斑里，BMP4主要表達(dá)在感覺(jué)斑毛細(xì)胞的胞漿中，集中在靠囊腔的一側(cè)，胞核及支持細(xì)胞里也有BMP4陽(yáng)性表達(dá)(圖1)。

2.2Smad4在小鼠內(nèi)耳前庭發(fā)育不同階段的表達(dá) 從E10到E12，小鼠內(nèi)耳沒(méi)有Smad4的表達(dá)；E13小鼠內(nèi)耳在橢圓囊始基和半規(guī)管及半規(guī)管壺腹嵴始基的上皮細(xì)胞里有非常弱的Samd4表達(dá)，E14時(shí)比E13的表達(dá)略為增強(qiáng)；E15時(shí)各個(gè)壺腹嵴、囊斑里均有明顯的較強(qiáng)的Smad4表達(dá)，此時(shí)的表達(dá)主要局限在各感覺(jué)斑的上皮細(xì)胞里，而內(nèi)耳周?chē)能浌悄掖藭r(shí)還沒(méi)有Smad4的表達(dá)；到E16時(shí)，各感覺(jué)斑和軟骨囊里的Smad4表達(dá)與E19時(shí)相同，均為強(qiáng)陽(yáng)性。感覺(jué)斑里的毛細(xì)胞、支持細(xì)胞均有Smad4表達(dá)，主要表達(dá)在毛細(xì)胞的胞漿中，核內(nèi)較少，而支持細(xì)胞主要表達(dá)在胞核(圖2)。

3 討論

BMPs是TGF-β超家族的重要成員，在早期胚胎發(fā)育和器官形成的多個(gè)方面均有著多種不同的生物學(xué)活性[4]，其中BMP4與軟骨或骨發(fā)育的關(guān)系早已明確[5～8]，而且BMP4也影響內(nèi)耳形態(tài)的形成[6，9，10]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致，支持BMP4參與內(nèi)耳形態(tài)形成的觀點(diǎn)。但是，BMP4在內(nèi)耳前庭發(fā)育的哪個(gè)階段開(kāi)始起作用的，目前不清楚。

內(nèi)耳骨迷路是軟骨化骨而來(lái)，而內(nèi)耳軟骨是耳周濃聚的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化而來(lái)。本研究發(fā)現(xiàn)，耳周間充質(zhì)開(kāi)始濃聚時(shí)就有BMP4的表達(dá)，具備了其參與耳周軟骨囊形成的條件，也就是說(shuō)，在內(nèi)耳前庭骨迷路發(fā)育剛被啟動(dòng)時(shí)BMP4就可能開(kāi)始起作用了。但BMP4并不是從一開(kāi)始就包繞整個(gè)內(nèi)耳，而是從局部表達(dá)開(kāi)始，再逐步擴(kuò)大，從文中結(jié)果看，開(kāi)始主要位于半規(guī)管始基周?chē)?，而且其在耳蝸囊周?chē)霈F(xiàn)的時(shí)間明顯晚于其在前庭囊周?chē)霈F(xiàn)的時(shí)間，這個(gè)過(guò)程可能正是耳周間充質(zhì)向軟骨轉(zhuǎn)化的過(guò)程。正是由于這個(gè)過(guò)程的存在，各處軟骨囊形成的時(shí)間先后不一，需要BMP4的時(shí)間也先后不一，當(dāng)BMP4基因剔出后，需要BMP4較晚的部位可能會(huì)激活其它的替代信號(hào)途徑，造成對(duì)小鼠內(nèi)耳不同部位產(chǎn)生不同的影響[6，11]。

內(nèi)耳膜迷路的發(fā)育起源于聽(tīng)板，文獻(xiàn)報(bào)道BMP4早在聽(tīng)板時(shí)期就有表達(dá)，對(duì)聽(tīng)板的發(fā)育有影響[12，13]。本研究從聽(tīng)板內(nèi)陷形成聽(tīng)凹繼而閉口形成聽(tīng)囊后開(kāi)始，結(jié)果提示BMP4的表達(dá)從E10開(kāi)始直到成年，貫穿了小鼠內(nèi)耳發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，在內(nèi)耳膜迷路有廣泛分布。其在E10聽(tīng)囊上皮里的充分表達(dá)早于間充質(zhì)濃聚的時(shí)間，說(shuō)明其對(duì)膜迷路發(fā)育的作用與對(duì)骨迷路發(fā)育的作用是相對(duì)獨(dú)立的，不僅僅與內(nèi)耳骨形態(tài)的形成有關(guān)，而且對(duì)膜迷路的形態(tài)形成可能也具有非常重要的作用。事實(shí)上，膜迷路大體形態(tài)基本形成以后，其周?chē)能浌悄也胖饾u形成，也提示對(duì)軟骨囊發(fā)育的影響只能部分影響到內(nèi)耳膜迷路的形態(tài)。

BMP4對(duì)內(nèi)耳感覺(jué)上皮分化發(fā)育的作用目前沒(méi)有統(tǒng)一的意見(jiàn)，有些研究支持其參與毛細(xì)胞分化發(fā)育，有些研究卻與此相反[6，9，14～16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)[17]提示其在各感覺(jué)斑上皮細(xì)胞里均有表達(dá)，推測(cè)其參與了毛細(xì)胞的分化發(fā)育是合理的。其主要表達(dá)在毛細(xì)胞內(nèi)，支持細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá)，提示其除了通過(guò)旁分泌作用影響上皮與上皮周?chē)信邔咏M織之間的作用，參與內(nèi)耳形態(tài)的發(fā)育之外，可能還參與了毛細(xì)胞、支持細(xì)胞的增殖及毛細(xì)胞的分化過(guò)程。其在毛細(xì)胞中主要位于胞漿靠腔面?zhèn)?，可能與其需要分泌到細(xì)胞外與胞膜上的受體作用后方可起作用有關(guān)。

圖1 BMP4在小鼠內(nèi)耳前庭發(fā)育不同階段的表達(dá)從E10(a)開(kāi)始，小鼠內(nèi)耳就有BMP4的表達(dá)。E10(a)和E11(b)小鼠聽(tīng)囊的上皮細(xì)胞里有較強(qiáng)的BMP4表達(dá)；E12(c、d)時(shí)聽(tīng)囊變長(zhǎng)且可分為明顯的前庭囊(VN)和耳蝸囊(CN)兩部分，BMP4主要表達(dá)在前庭囊以及前庭囊周?chē)鷿饩鄣亩荛g充質(zhì)；E13時(shí)BMP4在所有已出現(xiàn)的半規(guī)管、半規(guī)管壺腹、壺腹嵴(f)、囊及囊斑(e)里均有陽(yáng)性表達(dá)；到E15時(shí)(g～l)基本與出生后(m、n)的表達(dá)情況相當(dāng)，不再發(fā)生變化，軟骨囊里BMP4的表達(dá)基本勾畫(huà)出內(nèi)耳的大致形態(tài)。在感覺(jué)斑里，BMP4主要表達(dá)在感覺(jué)斑毛細(xì)胞的胞漿中，集中在靠囊腔的一側(cè)，胞核及支持細(xì)胞里也有BMP4陽(yáng)性表達(dá)。標(biāo)尺均為50 μm

圖2 Smad4在小鼠內(nèi)耳發(fā)育不同階段的表達(dá)E10～E12 Smad4表達(dá)陰性(a、b、c)；E13小鼠內(nèi)耳橢圓囊始基(d)和半規(guī)管及半規(guī)管壺腹嵴始基(e)的上皮細(xì)胞里有非常弱的Samd4表達(dá)； E15各個(gè)壺腹嵴(h)、囊斑(f、g)里均有較強(qiáng)的Smad4表達(dá)，主要局限在各感覺(jué)斑的上皮細(xì)胞里，但內(nèi)耳周?chē)能浌悄?i)Smad4表達(dá)陰性；E16時(shí)各感覺(jué)斑(j、k)和軟骨囊(l)里Smad4表達(dá)與E19(m、n、o)時(shí)相同，均為陽(yáng)性。表達(dá)在毛細(xì)胞的胞漿中，核內(nèi)較少，而支持細(xì)胞主要表達(dá)在胞核。標(biāo)尺為50 μm

Smads蛋白是BMP4受體復(fù)合物的下游信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，可將信號(hào)從細(xì)胞膜直接轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，從而對(duì)BMP4胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著關(guān)鍵的作用。其中，Smad4作為BMP4信號(hào)傳導(dǎo)通路中的通用Smad，在細(xì)胞增殖、分化、移行、凋亡等過(guò)程中可能起著尤其重要的作用，從而參與內(nèi)耳形成與感覺(jué)上皮分化的調(diào)控。理論上說(shuō)，有BMP4出現(xiàn)的時(shí)間、區(qū)域就會(huì)有Smad4的存在。但是，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)從E10到E12，小鼠內(nèi)耳沒(méi)有Smad4的表達(dá)，E13、E14也只有很弱的表達(dá)，這個(gè)發(fā)育階段里的BMP4只能通過(guò)非Smad信號(hào)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且耳周軟骨囊里直到E16才有明顯的Smad4表達(dá)，此時(shí)BMP4在耳周軟骨囊里已基本將內(nèi)耳輪廓勾畫(huà)出來(lái)。Smad4相對(duì)于BMP4的這種滯后表達(dá)的意義目前尚不清楚，有研究者推測(cè)Smad4在BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中不一定具有中心地位[11，18]，也許BMP-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與輪廓早期形成的關(guān)系不大而是與其稍晚的外形修飾及功能發(fā)育有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)Smad4剔除后內(nèi)耳輪廓基本完整但局部發(fā)生明顯畸形似乎支持這一推論[19]。

E13開(kāi)始小鼠內(nèi)耳有Samd4表達(dá)但很微弱，到E15時(shí)表達(dá)才比較明顯，且主要局限在壺腹嵴、囊斑，這與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)感覺(jué)斑里Myosin陽(yáng)性毛細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間一致(為本實(shí)驗(yàn)的其他數(shù)據(jù)，即將在第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)發(fā)表)，提示這二者間可能有某種聯(lián)系，可能BMP-Smad信號(hào)途徑在毛細(xì)胞的分化成熟中具有重要作用。Smad4基因剔除純合子(Smad4-/-)小鼠在胚胎發(fā)育早期死亡，Smad4基因剔除雜合子小鼠(Smad4+/-)與野生型小鼠(Smad4+/+)相比，其聽(tīng)力明顯下降，內(nèi)耳毛細(xì)胞嚴(yán)重缺失[20～22]，似乎證明了這一點(diǎn)。

總之，本研究可以肯定BMP4、Smad4在內(nèi)耳前庭發(fā)育中客觀存在，但BMP-Smad信號(hào)途徑在其中的作用并不明了。BMP4參與了內(nèi)耳前庭形態(tài)的形成及感覺(jué)上皮的分化發(fā)育，而Smad4可能主要參與了發(fā)育后期的形態(tài)塑形和功能發(fā)育。

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