劉秋，鐘世期，劉長(zhǎng)健，閆建芳，于基成

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116605）

益生菌Gan－1的鑒定、理化特性及其降膽固醇作用

劉秋，鐘世期，劉長(zhǎng)健，閆建芳，于基成

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116605）

從啤酒樣品中分離出一株具有較強(qiáng)的耐酸、耐鹽、耐膽鹽及降膽固醇能力的細(xì)菌菌株Gan－1。利用多相分類方法，即通過(guò)形態(tài)特征、生理生化特性以及16S rRNA核酸序列分析，鑒定出菌株Gan－1為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Gan－1）;采用MRS－Broth培養(yǎng)基，模擬人體胃酸環(huán)境、滲透壓環(huán)境和膽鹽環(huán)境，測(cè)定在酸性及高膽鹽環(huán)境作用下菌株Gan－1的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果表明，菌株能夠耐受pH3的環(huán)境、低于6%NaCl的高滲環(huán)境以及低于2.0%的膽鹽環(huán)境;菌株具有降解膽固醇的能力，培養(yǎng)至24 h時(shí)，降解的膽固醇達(dá)24%。

干酪乳桿菌;耐酸;耐膽鹽;降膽固醇

干酪乳桿菌（L.casei）是一種益生菌，能夠耐受口腔中的酶、胃液中的低pH值酸和小腸的膽汁酸等，可以在腸道內(nèi)大量存活，并能起到調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)人體消化吸收等作用。此外，干酪乳桿菌具有降低膽固醇、誘導(dǎo)其自身產(chǎn)生抗菌素、促進(jìn)細(xì)胞分裂和產(chǎn)生抗體免疫及抗癌等特性。

1 材料與方法

1.1 儀器

TC－512 Thermal Cycler PCR儀（Techne，英國(guó)）;凝膠成像系統(tǒng)（UVP，美國(guó)）;J2－MC型高速冷卻離心機(jī)（Beckman，美國(guó)）。

1.2 培養(yǎng)基

NBB培養(yǎng)基（購(gòu)買于德國(guó)柏林）;PYG培養(yǎng)基:參照文獻(xiàn)［1］;改良MRS培養(yǎng)基（100 mL）:胰蛋白胨1 g、牛肉浸膏0.8 g、酵母浸膏0.4 g、麥芽糖3.5 g、醋酸鈉0.5 g、吐溫80 0.1 mL、檸檬酸三銨0.2 g、磷酸氫二鉀0.2 g、硫酸鎂0.02 g、硫酸錳0.005 g、pH5.7±0.2;高膽固醇培養(yǎng)液MRSO－CHOL:參照文獻(xiàn)［1］。

1.3 菌株的分離及篩選

自啤酒發(fā)酵液中通過(guò)濾膜過(guò)濾（0.02 μm），采用NBB培養(yǎng)基厭氧分離培養(yǎng)7 d，分離獲得編號(hào)為Gan－1的菌株，經(jīng)純化后保存至含0.3%牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基中備用。

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 形態(tài)特征觀察

將菌株Gan－1在35℃恒溫下培養(yǎng)24 h，進(jìn)行形態(tài)特征觀察。

1.4.2 菌株Gan－1的DNA提取及16S rDNA序列分析

菌體Gan－1 DNA的提取方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［2］，菌株基因組的擴(kuò)增、產(chǎn)物回收、重組連接、轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆篩選均參照文獻(xiàn)［3］，引物為F27:5＇＞AGAGTTTGATCCTGGCTCAG＜3＇;R1492:5＇＞TACCTTGTTACGACTT＜3＇。測(cè)序委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。所得16S rDNA序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中與已知細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并將菌株16S rDNA序列提交Genbank進(jìn)行注冊(cè)。

1.4.3 菌株Gan－1的生化特性

辣椒不同種質(zhì)資源種子萌發(fā)期耐鹽性評(píng)價(jià)………………………………………… 高晶霞，顏秀娟，吳雪梅，謝 華，王學(xué)梅（102）

對(duì)菌株Gan－1分別進(jìn)行糖發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、精氨酸水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解、硝酸鹽水解等生理生化測(cè)定［4］。

1.5 菌株Gan－1的耐酸試驗(yàn)

配制菌株Gan－1的菌懸液（106 cfu·mL－1，以下同），按2%（體積比）的接種量接種至不同pH的MRS－Broth培養(yǎng)基中，35℃靜置培養(yǎng)12 h，于600 nm下測(cè)定OD值。

1.6 菌株Gan－1的耐鹽試驗(yàn)

按2%（體積比）的接種量接種至含不同濃度氯化鈉的MRS－Broth培養(yǎng)基中，35℃靜置培養(yǎng)12 h，于600 nm下測(cè)定OD值，測(cè)定菌株的耐滲透壓性。

1.7 菌株Gan－1的耐膽鹽試驗(yàn)

按2%（體積比）的接種量接種至添加不同濃度的牛膽鹽MRS－Broth培養(yǎng)基中，35℃靜置培養(yǎng)12 h，于600 nm下測(cè)定OD值。

1.8 菌株Gan－1的降膽固醇試驗(yàn)

按1%（體積比）的接種量接種至MRS－膽鹽－膽固醇培養(yǎng)基中，厭氧35℃培養(yǎng)20 h，然后離心除去菌體。上清液中的膽固醇含量采用鄰苯二甲醛法測(cè)定［6］。培養(yǎng)基中原有的膽固醇量與上清液中膽固醇量的差值為膽固醇的沉淀量。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株Gan－1的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將分離純化菌種在35℃恒溫下培養(yǎng)24 h，菌株gan－1的菌落形態(tài)為圓形，直徑1.0～3.5 mm，隆起，濕潤(rùn)，乳白色，不透明;菌體形態(tài)為圓端分節(jié)的桿狀，多數(shù)為C型2～9節(jié)，少數(shù)10節(jié)以上，寬0.1～1.5 μm，長(zhǎng)4.1～6.4 μm，集聚成團(tuán)或平行疊加（如圖1）;革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)芽孢，兼性厭氧。

圖1 菌株Gan－1的形態(tài)（×40）

2.1.2菌株Gan－1的生化特性

將菌株Gan－1與乳酸桿菌屬的模式菌株進(jìn)行生理生化特性比較，由測(cè)定結(jié)果可知，菌株Gan－1的H2O2酶試驗(yàn)、V－P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、明膠水解、淀粉水解、精氨酸水解、硝酸鹽利用、H2S試驗(yàn)均為陰性，與干酪乳桿菌（L.casei）的生理生化特性基本一致。但是，從糖利用試驗(yàn)結(jié)果可知，菌株Gan－1可利用麥芽糖和蔗糖作為碳源，這與干酪乳桿菌（L.casei）模式菌株有所差異。

2.1.3 菌株Gan－1的16S rDNA序列分析

菌株Gan－1的16S rDNA PCR基因擴(kuò)增結(jié)果如圖2，擴(kuò)增出1 600 bp左右的目的基因片段;利用BLAST搜索軟件將菌株Gan－1的16S rDNA序列測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明，菌株Gan－1與Lactococcus lactis，L.casei以及L.paracasei subsp paracasei同源性均達(dá)到99%。

圖216 S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 菌株Gan－1的耐酸試驗(yàn)

人體消化道正常pH值范圍為2～8，胃液pH值隨飲食結(jié)構(gòu)的變化波動(dòng)很大，通常pH值為3.0。本文選擇4個(gè)不同pH值進(jìn)行測(cè)試。人體消化過(guò)程約需4 h，而食品通過(guò)胃的時(shí)間相對(duì)較短，一般為1～2 h，因此設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間為4 h。菌種活化至活菌數(shù)約2×108cfu·mL－1，而活菌發(fā)揮功能特性的菌數(shù)臨界值為106cfu·mL－1，因此將經(jīng)酸作用后活菌對(duì)數(shù)下降小于2作為耐酸性標(biāo)準(zhǔn)［7］。試驗(yàn)結(jié)果如圖3。菌株Gan－1在pH值為3.0條件下，2 h后活菌數(shù)由108cfu·mL－1降至107cfu· mL－1，4 h后活菌數(shù)仍在106cfu·mL－1以上;在pH值為2條件下，2 h后活菌數(shù)降至105cfu· mL－1，4 h后活菌數(shù)降至104cfu·mL－1。由此可以看出，菌株Gan－1耐受pH值為3的酸性環(huán)境。食物攝入2 h后通過(guò)胃到達(dá)腸道。該菌株耐受胃酸，可以通過(guò)胃進(jìn)入腸道發(fā)揮作用。

圖3 耐酸試驗(yàn)結(jié)果

2.3 菌株Gan－1的耐鹽試驗(yàn)

菌株Gan－1在不同滲透壓下的耐受結(jié)果如圖4。由圖4可知，菌株Gan－1在含6.0%NaCL的培養(yǎng)基中仍能生長(zhǎng)，說(shuō)明其耐滲透壓的效果很好。

圖4 耐鹽試驗(yàn)結(jié)果

2.4 菌株Gan－1的耐膽鹽試驗(yàn)

人體不同部位的膽汁酸的濃度不同。膽汁酸鹽含量為0.3%～0.5%、膽鹽含量為0.3%是衡量菌株耐受人體腸道膽汁酸的標(biāo)準(zhǔn)。耐酸試驗(yàn)（pH3）中，菌株Gan－1在2 h后通過(guò)胃到達(dá)腸道，活菌數(shù)降至3×107cfu·mL－1，因此耐膽鹽試驗(yàn)接種量設(shè)定為3×107cfu·mL－1。食物通過(guò)腸道的時(shí)間約2～3 h，設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間4 h。試驗(yàn)結(jié)果如圖5。菌株Gan－1在0.3%膽鹽環(huán)境下活菌數(shù)有所下降，但3 h后活菌數(shù)仍在106cfu·mL－1以上，高于活菌發(fā)揮功能特性的菌數(shù)臨界值。菌株Gan－1對(duì)不同膽鹽的耐受性沒(méi)有顯著差異。由此表明，所篩選菌株具有一定的抗膽汁鹽能力，可順利通過(guò)小腸到達(dá)大腸。

圖5 耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

2.5 菌株Gan－1的降膽固醇試驗(yàn)

在0.3%膽鹽含量下測(cè)定菌株Gan－1的降解膽固醇能力，試驗(yàn)結(jié)果如圖6。在24 h內(nèi)，菌株Gan－1生長(zhǎng)狀態(tài)良好，膽固醇的降解率也逐步升高，至24 h時(shí)，降解的膽固醇達(dá)24%。

圖6 不同時(shí)間培養(yǎng)液中膽固醇降解率

3 結(jié)論

干酪乳桿菌（L.casei）相關(guān)菌株是經(jīng)長(zhǎng)期驗(yàn)證對(duì)人體無(wú)毒副作用，且廣泛用于保健食品生產(chǎn)的益生菌。關(guān)于干酪乳桿菌的分類地位一直多有爭(zhēng)議，本文利用16S rDNA核酸序列比對(duì)分析中，菌株Gan－1與乳酸乳球菌（L.lactis）、副干酪乳桿菌亞種（L.paracasei subsp paracasei）、干酪乳桿菌（L.casei）親緣關(guān)系均較近，但乳酸乳球菌細(xì)胞呈球形或卵圓形，與菌株Gan－1的菌體形態(tài)差別較大。Dellagio等根據(jù)可溶性蛋白電泳圖譜分析和DNA－DNA同源性分析，取消了副干酪乳桿菌亞種（L.paracasei subsp paracasei）的名稱，將其合并為L(zhǎng).casei。本文將菌株Gan－1與L.casei的模式菌株的形態(tài)特征、生理生化特性進(jìn)行了比較分析，二者在糖源利用上存在一定的差異，菌株Gan－1可利用麥芽糖和蔗糖作為碳源，因此將菌株Gan－1鑒定為L(zhǎng).casei的一個(gè)亞種。

活菌含量106cfu·mL－1是菌株發(fā)揮降膽固醇功能特性的菌數(shù)臨界值。胃酸和膽鹽具有抗菌作用，乳酸桿菌被食入后不僅要通過(guò)惡劣的胃液，還要抵抗來(lái)自胰腺的膽鹽。因此耐酸、耐膽鹽特性是乳酸桿菌作為功能性食補(bǔ)因子的重要指標(biāo)之一，并由計(jì)算得出pH值為3、膽鹽為0.3%是衡量菌株耐受人體胃腸道的標(biāo)準(zhǔn)。本文模擬人體胃腸環(huán)境，以菌株的初始接種量為2×108cfu· mL－1，經(jīng)耐酸、耐膽鹽連續(xù)試驗(yàn)，活菌數(shù)仍在106cfu·mL－1以上，表明有足夠數(shù)量的菌株Gan－1通過(guò)胃腸道而保持活性，發(fā)揮降膽固醇的益生作用。

目前干酪乳桿菌（L.casei）多從乳制品中獲得，對(duì)開(kāi)發(fā)功能性乳制品具有重要意義。而菌株Gan－1是從啤酒樣品中分離獲得，其不僅對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求更為簡(jiǎn)單，同時(shí)其較高的活性也使該菌株不僅應(yīng)用領(lǐng)域更寬泛，并可用于食品的防腐保鮮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株同樣具有耐酸、耐膽鹽和降解膽固醇的能力，可作為益生菌的備選菌株，但需要保證食品中一定的活菌數(shù)目。

［1］劉麗莉，董鐵有，楊協(xié)立.6種乳酸菌降解膽固醇的體外試驗(yàn)［J］.河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，12（6）:85－88.

［2］朱炳林，張茜茜，方維煥.瑞士乳酸桿菌HZ521株的分子鑒定及其部分生物學(xué)特性研究［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（2）:49－52.

［3］張剛.乳酸細(xì)菌基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

［4］胡書(shū)芳，王雁萍，洪愛(ài)俊，等.自然發(fā)酵酸菜中乳酸菌的分離鑒定及其生理特性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（15）:6896－6898.

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Identification，Physico－chemical Characteristics of Strain Gan－1 and its Effect of Cholesterol Reducing in Vitro

LIU Qiu，ZHONG Shi－qi，LIUChang－jian，YAN Jian－fang，YU Ji－cheng
（College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China）

A strain Gan－1 which has the strong resistant ability for acid，salt，and bile salt and the good cholesterol reducing was screened from beer samples.The morphological，physiological，biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence of the strain Gan－1 were analyzed.Then the strain Gan－1 was identified as Lactobacillus casei Gan－1 by polyphasic taxonomy method.By stimulating human gastric acid and intestinal bile salt condition，the viability of Gan－1 strain during exposure to acid MRS broth，high salt MRS broth and bile salt MRS broth were determined，respectively.Then the bile salt hydrolase activity of Gan－1 strain，degradation of bile salt and cholesterol precipitation were measured in this bile salt concentration.The results show that the strain Gan1 has tolerance capability to the pH=3，6%salt and 0.3%bile salt environment and can reduce cholesterol.In MRS medium with cholesterol，strain Gan－1 degrades 24%of cholesterol.

lactobacillus casei;acid resistant ability;bile salt resistant ability;cholesterol reduction

Q935

A

1009－315X（2012）03－0198－04

2011－12－06;最后

2011－12－20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070005）;中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（DC10030102，DC10030102）。

劉秋（1969－），女，遼寧大連人，教授，博士，學(xué)校優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人主要從事微生物學(xué)研究。

（責(zé)任編輯 鄒永紅）