金華，鄒吉祥，樸仁哲，郭鵬，吳凡，姜國(guó)斌

（1.大連民族學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧大連 116605; 2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000）

金針菇rDNA－ITS序列分析

金華1，鄒吉祥2，樸仁哲2，郭鵬1，吳凡1，姜國(guó)斌1

（1.大連民族學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧大連 116605; 2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000）

為研究金針菇rDNA－ITS序列特征，提取了不同來(lái)源金針菇子實(shí)體的基因組DNA，對(duì)其rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，并提交NCBI獲得登錄號(hào);將不同產(chǎn)地的金針菇ITS序列與本研究獲得的金針菇ITS序列進(jìn)行對(duì)比分析，利用ITS序列分析技術(shù)研究其遺傳多樣性，并構(gòu)建了NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，所有供試材料的ITS全長(zhǎng)在710～719 bp范圍內(nèi)，G+C含量在49.3%～49.9%，所有序列共有34個(gè)變異位點(diǎn)，16個(gè)信息位點(diǎn)，ITS區(qū)遺傳距離變化范圍為0～0.016，即不同產(chǎn)地的金針菇ITS序列在進(jìn)化過(guò)程中存在差異。此結(jié)果可為真菌分類(lèi)鑒定等研究提供重要的資料和依據(jù)。

金針菇;ITS序列;系統(tǒng)發(fā)育

金針菇（Flammulina velutipes）別名又稱(chēng)毛柄小火菇、構(gòu)菌、樸菇、冬菇、樸菰、凍菌、金菇、智力菇等，屬傘菌目白蘑科金錢(qián)菌屬?！敖疳樄健?、“銀針菇”為真菌植物門(mén)真菌毛柄金錢(qián)菌的子實(shí)體。目前栽培的金針菇菌株中，有表現(xiàn)野生型的黃褐色菌株、突變的純白菌株和一系列中間顏色的淺黃菌株［1］，金針菇菌蓋滑嫩、菌柄細(xì)長(zhǎng)脆嫩、形美、味鮮，是世界上著名的食、藥兩用菌和觀賞菌，有廣闊的開(kāi)發(fā)前景［2－3］。金針菇在自然界廣為分布，中國(guó)、日本、俄羅斯、歐洲、北美洲、澳大利亞等地均有分布。在中國(guó)北起黑龍江，南至云南，東起江蘇，西至新疆均適合金針菇的生長(zhǎng)。ITS序列在物種屬內(nèi)、近緣屬間乃至科內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究中有一定的價(jià)值。真菌核糖體基因由小的亞單元（18S）、ITS1區(qū)、5.8s區(qū)、ITS2區(qū)和大的亞單元（28s）構(gòu)成，頭尾串聯(lián)形成重復(fù)序列，一個(gè)基因組內(nèi)有20～60個(gè)拷貝。真菌ITS區(qū)域長(zhǎng)度一般在650～750 bp。ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析［4］。核rDNA－ITS分子序列的進(jìn)化較穩(wěn)定、獨(dú)立，變異較豐富，序列分析受主觀因素的影響也較小。ITS片段在進(jìn)化過(guò)程中承受的自然選擇壓力非常小，因此能夠容納更多的變異。由于ITS的序列分析能實(shí)質(zhì)性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對(duì)差異，而且ITS序列片段較小，易于分析，已被廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)金針菇ITS序列研究報(bào)道較少，本研究通過(guò)對(duì)遼寧省大連市和沈陽(yáng)市兩個(gè)地區(qū)的金針菇樣品進(jìn)行ITS序列分析，并與在Gen-Bank中的其他金針菇ITS序列進(jìn)行比較，分析不同產(chǎn)地金針菇的親緣關(guān)系，以期為金針菇屬的分子鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2種金針菇分別來(lái)自遼寧省的大連市和沈陽(yáng)市，子實(shí)體均為純白色，是兩地的主栽品種。將大連市金針菇ITS序列提交NCBI，并獲得登錄號(hào);沈陽(yáng)市金針菇ITS序列如下;另有8種金針菇的ITS序列來(lái)自GenBank。供試材料編號(hào)及產(chǎn)地見(jiàn)表1。

沈陽(yáng)市金針菇ITS序列為:

表1 供試材料編號(hào)及產(chǎn)地

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用SDS法配合微型電鉆研磨法［5］提取金針菇DNA。將提取的DNA用0.8%凝膠電泳檢測(cè)后置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增ITS區(qū)段

采用金針菇ITS序列的通用引物ITS1（5'—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3'）和ITS4（5'—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3'）對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海生物工程公司合成。

25 μL PCR反應(yīng)體系:2.5 μL 10×PCR buffer （Mg2+）2.5 mmol·L－1、2 μL dNTP 2.5 mmol· L－1，引物分別加入0.5 μL（10 μL·L－1）、0.5 μL Taq DNA聚合酶（5U·μL－1）、0.5 μL DNA模板，用水補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min，94℃變性40 s，52℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃保溫5 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 ITS測(cè)序分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將擴(kuò)增出的核酸片段在上海生物工程公司純化后測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST工具和DNAMAN軟件配合手動(dòng)排序、G+C含量和變異位點(diǎn)分析，獲得的序列使用ClustalVersion2.1進(jìn)行比對(duì)，選擇一條序列作為代表序列，并在GenBank注冊(cè)，所得序列號(hào)見(jiàn)表1。利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析比對(duì)，并以自展法（bootstrap）進(jìn)行檢測(cè)，共循環(huán)1 000次，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（Neighbor joining tree）。使用MEGA5.0中的Maximum Composite Likelihood模型構(gòu)建序列遺傳距離矩陣。

2 結(jié)果與討論

2.1 ITS序列長(zhǎng)度與G+C含量分析

所有供試材料ITS總長(zhǎng)度在710～719 bp（見(jiàn)表1），G+C質(zhì)量分?jǐn)?shù)為49.3%～49.9%。其中ITS1在242～249 bp，G+C質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.2%～48.3%;ITS2在308～311 bp，G+C質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.1%～53.6%。所有材料5.8 s長(zhǎng)度均為159 bp，且G+C質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為46.5%，說(shuō)明5.8 s rDNA進(jìn)化過(guò)程中高度保守［4，6－8］。分析表明，ITS2大于ITS1的長(zhǎng)度，金針菇ITS區(qū)G+C質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較小，總體上ITS2序列的G+C質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于ITS1。

2.2 ITS排序及序列位點(diǎn)的分析

通過(guò)Clustalx1.83對(duì)序列進(jìn)行排序，所有序列共有34個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異，其中可用于分析的信息位點(diǎn)16個(gè)，ITS1區(qū)有6個(gè)，ITS2區(qū)有10個(gè)（見(jiàn)表2）。

表2 供試材料ITS的變異信息位點(diǎn)

堿基變異類(lèi)型有C—T和G—A轉(zhuǎn)換、C—G和T—G顛換、缺失變異。T→C轉(zhuǎn)換8個(gè)，占50%;A→G轉(zhuǎn)換1個(gè)，占6.3%;C→G顛換2個(gè)，占12.5%;T→G顛換1個(gè)，占6.5%;9個(gè)缺失位點(diǎn)，占56.3%，說(shuō)明堿基變異類(lèi)型主要以缺失和轉(zhuǎn)換為主。ITS區(qū)共有變異位點(diǎn)34個(gè);信息位點(diǎn)16個(gè)，占總變異位點(diǎn)的47.06%。其中ITS1有22個(gè)變異位點(diǎn)，6個(gè)變異信息位點(diǎn)，占總變異位點(diǎn)的27.27%;ITS2有12個(gè)變異位點(diǎn)，10個(gè)變異信息位點(diǎn)，占總變異位點(diǎn)的83.33%。ITS1變異位點(diǎn)數(shù)量高于ITS2，但I(xiàn)TS2的變異信息位點(diǎn)數(shù)明顯高于ITS1。

2.3 金針菇ITS序列遺傳距離分析

采用MEGA5.0根據(jù)Maximum Composite Likelihood參數(shù)分析得到序列間遺傳距離（見(jiàn)表3）。10種金針菇樣品的平均距離為0.008。遺傳距離最大為0.016，樣品1、樣品2、樣品8、樣品10的遺傳距離最小，為0.000，說(shuō)明它們的ITS序列為同源序列。樣品5和樣品6接近0.001，說(shuō)明同源性很近。其余樣品遺傳距離均小于0.1，說(shuō)明它們之間的遺傳關(guān)系較近，其遺傳分化可能發(fā)生很晚或者種群間的基因流動(dòng)發(fā)生頻繁。

表3 基于rDNA－ITS序列的遺傳距離比較

2.4 金針菇系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用MEGE 5.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（如圖1），并用靴帶自展法（bootstrap）檢驗(yàn)發(fā)育樹(shù)，重復(fù)1 000次，以判斷各分支處的可信度。樣品5、樣品6自成一支，表明這2個(gè)樣品極其相似，得到了bootstrap值的有力支持（99%），并且與其余8個(gè)樣品處于樹(shù)的兩大分支上，說(shuō)明與其他樣品差異較大。而在其余9個(gè)樣品中，樣品4和樣品7自成1支，表明這兩個(gè)樣品在ITS區(qū)極其相似，得到了bootstrap值的有力支持（84%）。

圖1 基于ITS序列構(gòu)建10種金針菇材料的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)語(yǔ)

本文從rDNA的ITS序列分析了不同產(chǎn)地金針菇的變異信息、遺傳距離，以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)總變異位點(diǎn)數(shù)34個(gè)，占全序列的4.77%，信息位點(diǎn)16個(gè)，占2.24%，可見(jiàn)，金針菇ITS序列在進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)化信息較為豐富。盡管各金針菇樣品間親緣關(guān)系較近，但仍能具體劃分出各樣品間的關(guān)系，說(shuō)明ITS序列分析可作為一種用于真菌分類(lèi)鑒定的分子標(biāo)記方法。然而，個(gè)別真菌由于進(jìn)化順序、變異，甚至分析方法等原因，在間隔區(qū)表現(xiàn)的差異性比較小，各種類(lèi)間ITS序列的分析還不明顯，單純依靠ITS序列并不能對(duì)金錢(qián)菌屬種類(lèi)進(jìn)行有效的分類(lèi)鑒定，因此需要結(jié)合其他的分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行分類(lèi)鑒定，以提高對(duì)真菌類(lèi)分子鑒定的準(zhǔn)確度和靈敏度，例如將其與分子信息學(xué)、形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生化學(xué)等結(jié)合進(jìn)行綜合分析，金針菇屬親緣關(guān)系的鑒定將會(huì)更準(zhǔn)確、可靠和快速。

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Sequence Analysis of rDNA－ITS of Flammulina Velutipes

JIN Hua1，ZOU Ji－xiang2，PIAO Ren－zhe2，GUO Peng1，WU Fan1，JIANG Guo－bin1
（1.College of Enviroment Science and Engineering，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China;2.College of Agriculture，Yanbian University，Yanji Jilin 133000，China）

To study the characteristics of the sequences of internal transcribed spacer of ribosomal DNA from Flammulina velutipes，the genomic DNA in the fruiting bodies of Flammulina velutipes from different origins were extracted.The internal transcribed spacer of DNA was amplified using PCR and ITS sequences were obtained.NCBI was submitted to the GenBank Databases of and registered number was obtained.The ITS sequences of Flammulina velutipes in this research were compared with those of different habitats relatives downloaded from GenBank by MEGA，BLAST，DNAMAN and Clustalx programs.Their genetic diversities were studied by ITS sequences analysis technology.Based on DNA sequencing and alignment with GenBank，the phylogenetic tree was constructed by neighbor joining methods.The results show that all the materials’sequences of ITS are in the range from 710 to 719bp in size and G+C content is varied from 49.3%to 49.9%.There are 36 variable sites and 13 information sites in ITS.The range of genetic distances and genetic differentiation vary from 0 to0.016.This shows that sample of different habitats have some differences seen in the course of evolution.The results provide the important data and evidence for related fungus classify system.

Flammulina velutipes;internal transcribed spacer（ITS）sequence;phylogeny

S646.1

A

2011－12－15;最后

2012－03－15

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（DC10040105）;吉林省科技廳項(xiàng)目（21200253）。

金華（1971－），女，朝鮮族，吉林延吉人，副教授，博士，主要從事植物分子分類(lèi)及逆境植物生物學(xué)研究。

（責(zé)任編輯 鄒永紅）