房 霞，韓明子，張 敏，金世柱，王洪亮

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，黑龍江哈爾濱 150086

SCF和G－CSF對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療急性肝損傷的研究

房 霞，韓明子，張 敏，金世柱，王洪亮

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，黑龍江哈爾濱 150086

目的探索聯(lián)合應(yīng)用干細(xì)胞因子(SCF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G－CSF)動(dòng)員骨髓單個(gè)核細(xì)胞向急性肝損傷小鼠肝臟的遷移情況及對(duì)肝損傷的修復(fù)作用。方法應(yīng)用CCl4/2－AAF制備急性肝損傷模型，然后行骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植(體外先經(jīng)PKH26標(biāo)記)和皮下注射細(xì)胞因子SCF、G－CSF(實(shí)驗(yàn)按注射細(xì)胞因子的種類隨機(jī)分為4組，A組:SCF+G－CSF;B組:SCF;C組:GCSF;D組:移植對(duì)照組)，分別于移植后2周、4周處死小鼠，取其血清檢測(cè)肝功(ALT、AST、ALB值)，取肝組織觀察小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞向肝臟遷移的情況及損傷肝臟的修復(fù)情況。結(jié)果(1)PKH26標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):A組＞C組＞B組、D組。A組與C組、B組、D組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);(2)病理組織學(xué)檢測(cè):A組小鼠肝臟修復(fù)較其他組好;(3)肝功指標(biāo):與B組、C組、D組比較，A組ALT，AST值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，ALB值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);移植后4周與2周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論(1)SCF和G－CSF可以通過動(dòng)員骨髓干細(xì)胞促進(jìn)急性肝損傷小鼠肝臟的修復(fù)。(2)聯(lián)合應(yīng)用SCF和GCSF比單獨(dú)應(yīng)用更能有效保護(hù)受損肝臟，并加快受損肝臟的再生。

干細(xì)胞因子;粒細(xì)胞集落刺激因子;骨髓單個(gè)核細(xì)胞;急性肝損傷;移植

肝移植用于治療終末期肝病，盡管技術(shù)上取得了一定的進(jìn)步，但并發(fā)癥及死亡率仍高，而一部分患者由于供肝短缺而在等待中死亡。進(jìn)行危險(xiǎn)性更小的肝細(xì)胞移植替代肝移植或作為患者等待供肝的過渡性移植無疑具有廣闊的前景［1］。目前，干細(xì)胞研究已在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了令人矚目的成就，也為終末期肝病的治療提供了新思路［2］。如何將干細(xì)胞高效率的誘導(dǎo)成肝細(xì)胞及如何安全有效的植入受損肝臟是目前亟待解決的問題。而細(xì)胞因子動(dòng)員干細(xì)胞的方式簡(jiǎn)單、無創(chuàng)，細(xì)胞因子的應(yīng)用為干細(xì)胞治療肝臟疾病開創(chuàng)了新的前景。

SCF和G-CSF對(duì)骨髓干細(xì)胞均有動(dòng)員作用，G-CSF的動(dòng)員作用強(qiáng)于SCF的動(dòng)員作用，二者聯(lián)合使用動(dòng)員效果更強(qiáng)。大量試驗(yàn)［3-7］均證實(shí)了SCF和G-CSF對(duì)骨髓干細(xì)胞的遷移、歸巢和促分化作用。雖然SCF和G-CSF單獨(dú)應(yīng)用均可修復(fù)肝損傷，但二者在肝損傷治療方面的聯(lián)合應(yīng)用目前鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探索聯(lián)合應(yīng)用SCF和G-CSF動(dòng)員骨髓單個(gè)核細(xì)胞向急性肝損傷小鼠肝臟的遷移情況及對(duì)肝損傷的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，恒溫(22℃)，光照周期(12 h:12 h)，自由食水，購(gòu)買于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組:A組(16只):rmSCF+rhG-CSF+骨髓移植組;B組(16只):rmSCF+骨髓移植組;C組(16只):rhG-CSF+骨髓移植組;D組(16只):僅骨髓移植組;E組(5只):模型檢測(cè)組;F組(48只):供體組。

1.1.3 主要試劑:重組鼠干細(xì)胞因子(rmSCF)Pepro-Tech公司;重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)，麒麟鯤鵬生物藥業(yè)有限公司;紅色熒光染料PKH26美國(guó)Sigma公司;2-乙酰氨基芴(2-AAF)，F(xiàn)luka Biochemika;四氯化碳哈爾濱市鑫鵬化學(xué)試劑廠;小鼠淋巴細(xì)胞分離液，天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?聚乙二醇-400，天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司;DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清Invitrogen公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 肝損傷模型的制備和檢測(cè):將溶于聚乙二醇的2-乙酰氨基芴按20 mg/kg灌胃共7 d，第8天按20 mL/kg腹腔注射0.1%四氯化碳橄欖油溶液，第9天行骨髓移植，第10天起繼續(xù)按20 mg/kg灌胃2-乙酰氨基芴。模型檢驗(yàn):四氯化碳腹腔注射24 h后將E組5只小鼠摘眼球取血檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及白蛋白(ALB)值，并取出肝臟，蘇木素-伊紅染色觀察其病理變化。

1.2.2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液的制備:取F組健康雄性BALB/c小鼠，摘眼球取血，離心后取其血清，暫時(shí)存放于－20℃冰箱內(nèi)，待測(cè)ALT、AST、ALB值。將剛處死的小鼠碘伏消毒腿部皮膚，無菌手術(shù)取出供體鼠雙側(cè)股骨，放于無菌紗布上，用紗布盡量剝?nèi)ゼ∪饨M織，剪掉股骨兩端，用無菌DMEM培養(yǎng)基，從一端插入骨髓腔，沖洗出骨髓，收無菌離心管中，再經(jīng)過7→5號(hào)針頭，吸管吹打成均勻的細(xì)胞懸液。

1.2.3 骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離與染色:將上述制備的細(xì)胞懸液以3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，另取無菌離心管，加入2 mL密度為1.092的小鼠淋巴細(xì)胞分離液，將2 mL骨髓細(xì)胞重懸液加入裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，1 500 r/min離心，20 min，可見離心管中液體分為4層，用無菌吸管將第2層(從上向下數(shù))粉紅色云霧狀液體移入另一無菌離心管中，用PBS稀釋。用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)已分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，每只動(dòng)物分離出約2×107個(gè)單個(gè)核細(xì)胞(所有操作均在25℃進(jìn)行)。將上述制備的骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液用5 mL PBS洗滌1次，3 000 r/min離心5 min，使細(xì)胞在離心管底部形成一個(gè)松散的細(xì)胞團(tuán)，小心吸去上清，細(xì)胞團(tuán)上剩余液體＜25 μL。加入2 mL Diluent C重懸細(xì)胞保證細(xì)胞完全離散。以微量加樣器取16 μL PKH26放入另一已裝有2 mL Diluent C的離心管中，將骨髓細(xì)胞和Diluent C混懸液加入已裝有PKH26和Diluent C的離心管中并迅速混勻，25℃孵育2～5 min，定時(shí)輕輕搖動(dòng)離心管，加入等量血清終止染色反應(yīng)，孵育1 min，再用等量含血清DMEM培養(yǎng)基稀釋終止的反應(yīng)液，3 000 r/min 25℃ 離心10 min，去上清。細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)入新試管中，PBS洗滌3次，加完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)至3×107/mL。(所用的PKH26濃度為4 μmol/L)。將細(xì)胞懸液調(diào)至106個(gè)/mL，取9滴細(xì)胞懸液于試管中，加1滴 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液，搖勻。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在3min分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(未染色者)和死細(xì)胞數(shù)(染色者)?；罴?xì)胞率=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。細(xì)胞成活率＞95%，可用于細(xì)胞移植。

1.2.4 骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植:A組:將小鼠置于簡(jiǎn)易固鼠器中，用碘伏消毒尾部，于四氯化碳損傷1 d后經(jīng)尾靜脈注入0.3 mL骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)均為3×106個(gè))。同時(shí)，碘伏消毒腹部皮膚，連續(xù)5 d皮下注射 rmSCF(10 ug/kg·d)、rhG-CSF(30 ug/kg·d)。B組:碘復(fù)消毒尾部皮膚，于肝損傷1 d后經(jīng)尾靜脈注入等體積骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液，同時(shí)給予皮下注射等量rmSCF。C組:碘復(fù)消毒尾部皮膚，于肝損傷1 d后經(jīng)尾靜脈注入等體積骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液，同時(shí)給予皮下注射等量rhG-CSF。D組:碘復(fù)消毒尾部皮膚，于肝損傷1 d后經(jīng)尾靜脈注入等體積骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液，同時(shí)給予皮下注射等量生理鹽水。

1.2.5 標(biāo)本收集、保存及檢測(cè):分別于骨髓干細(xì)胞移植2周、4周后摘眼球取全血，離心采集血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST及ALB值。小鼠處死后迅速取肝組織，一部分肝組織置液氮中速凍，待制備冰凍切片，熒光顯微鏡觀察骨髓單個(gè)核細(xì)胞向肝臟遷移的情況。另一部分肝組織在4℃下用40 g/L多聚甲醛固定48 h以上，石蠟包埋和切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞的壞死及修復(fù)情況。

1.2.6 檢測(cè)指標(biāo):干細(xì)胞移植情況:取鼠肝組織制備冰凍切片，熒光顯微鏡觀察已標(biāo)記PKH26的干細(xì)胞向肝臟遷移的情況。肝功變化:比較各組及同組不同時(shí)間點(diǎn)血清中AST、ALT、ALB的值。病理學(xué)改變:肝臟的大體形態(tài):質(zhì)地、邊緣、顏色、表面是否光滑等。肝臟的病理組織學(xué)改變:肝細(xì)胞壞死程度、組織修復(fù)程度等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 20倍鏡下，每張冰凍切片隨機(jī)觀察10個(gè)非重復(fù)視野，將熒光標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相加，記為 PKH26陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/切片。ALT、AST、ALB、PKH26陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/切片用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用析因設(shè)計(jì)方差分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性肝損傷模型的檢驗(yàn) E組小鼠ALT、AST及ALB 值分別為:1978.12 ±795.07 U/L、2610.28 ±217.01 U/L、36.33 ±0.70 g/L。HE 染色結(jié)果顯示:肝細(xì)胞大面積壞死，以中央小葉區(qū)壞死為主，壞死區(qū)肝細(xì)胞核消失，周圍肝細(xì)胞胞漿疏松化(見圖7、8)，證明急性肝損傷模型建立成功。

2.2 PKH26標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè) PKH26在波長(zhǎng)551 nm的激發(fā)光作用下發(fā)出紅色熒光，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟組織冰凍切片上均可見紅色的熒光光點(diǎn)，提示體外經(jīng)PKH26標(biāo)記的骨髓單個(gè)核細(xì)胞能夠遷移至肝臟。移植2周后遷移至肝臟的骨髓單個(gè)核細(xì)胞主要位于匯管區(qū)，而4周后骨髓單個(gè)核細(xì)胞均勻分散在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)(見圖1～6)。圖1～2骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植后2周，移植的細(xì)胞主要位于匯管區(qū)，尚未彌漫性分散到肝實(shí)質(zhì)內(nèi)。圖3～6骨髓細(xì)胞移植后4周各組熒光圖片，PKH26標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):A組＞C組＞B組、D組。同一時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組間相比較，A組熒光細(xì)胞數(shù)目較其他組多(P＜0.05)，同一實(shí)驗(yàn)組移植后2周與4周相比，遷移的細(xì)胞數(shù)目無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表1)。結(jié)果表明:SCF和G-CSF均可動(dòng)員骨髓干細(xì)胞向受損肝臟遷移，二者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。

2.3 肝臟組織學(xué)檢測(cè) HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，相同時(shí)間點(diǎn)A組、B組、C組均較D組損傷輕(2周、4周，其中A組較B組、C組輕，B組和C組無明顯差別;移植后4周與2周時(shí)比較，肝臟損傷較輕，其中A組肝組織4周時(shí)已基本上恢復(fù)正常(見圖7～16)。圖7～8急性肝損傷模型HE染色圖片，可見肝細(xì)胞大面積壞死，以中央小葉區(qū)壞死為主，壞死區(qū)肝細(xì)胞核消失，周圍肝細(xì)胞胞漿疏松化，可見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。圖9～10A組小鼠骨髓細(xì)胞移植后2周、4周HE染色圖片，圖9可見肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性，小灶狀壞死，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)可見移植的骨髓單個(gè)核細(xì)胞。圖10肝細(xì)胞幾乎恢復(fù)正常，無壞死。圖11～14B組，C組小鼠骨髓細(xì)胞移植后2周、4周HE染色圖片，圖11、13可見肝細(xì)胞彌漫性變性腫脹，小灶狀壞死，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)可見骨髓單個(gè)核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。圖12、14肝細(xì)胞變性減輕，仍可見少量點(diǎn)狀壞死。圖15～16D組小鼠骨髓細(xì)胞移植后2周、4周HE染色圖片，圖15可見肝細(xì)胞彌漫性變性，腫脹明顯，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)可見骨髓單個(gè)核細(xì)胞。圖16肝細(xì)胞彌漫變性，仍明顯腫脹，空泡變明顯。各組均可見遷移至肝臟的骨髓單個(gè)核細(xì)胞。結(jié)果表明:SCF與G-CSF單獨(dú)應(yīng)用對(duì)受損肝臟的修復(fù)有一定作用，但作用均較弱，二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)受損肝臟的修復(fù)作用效果較單獨(dú)應(yīng)用好。

2.4 肝功檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST、ALB值，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行析因設(shè)計(jì)方差分析，結(jié)果見表2～4。結(jié)果表明:ALT、AST值改善程度大小依次為:A組＞C、B組＞D組，B組與C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。骨髓細(xì)胞移植后4周與2周比較，4周時(shí)ALT、AST值基本已經(jīng)達(dá)到正常或接近正常值。而ALB值各組間及各時(shí)間點(diǎn)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)表明:SCF+G-CSF+骨髓細(xì)胞移植組ALT、AST值改善較其他組明顯，肝臟修復(fù)也較其他組好。

表1 肝臟冰凍切片中PKH26標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(± s)Tab 1 The contract of PKH26 labeled positive cells in the liver of four groups(± s)

表1 肝臟冰凍切片中PKH26標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(± s)Tab 1 The contract of PKH26 labeled positive cells in the liver of four groups(± s)

★與D組比較，P＜0.05;△與A組比較，P＜0.05;☆與C組比較，P ＜0.05;◇與2周比較，P＞0.05

組別 例數(shù)(只) PKH26標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/切片)2周 4周A 組 16 106.75 ±13.19★ 115.13 ±7.89★◇B 組 16 55.25 ±2.96★△ 59.63 ±5.93★△◇C 組 16 84.38 ±4.81★△☆ 85.00 ±3.93★△☆◇D 組 16 52.25 ±8.17◇ 54.13 ±4.19◇

表2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植對(duì)小鼠血清ALT水平的影響(± s)Tab 2 The level of ALT in the serum of mice after bone marrow mononuclear cells transplantation(± s)

表2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植對(duì)小鼠血清ALT水平的影響(± s)Tab 2 The level of ALT in the serum of mice after bone marrow mononuclear cells transplantation(± s)

★與D組比較，P＜0.05;△與A組比較，P＜0.05;◇與B組比較，P ＞0.05;☆與2周比較，P＜0.05

組別 例數(shù)(只) ALT值(U/L)2周 4周A 組 16 66.38 ±16.09★ 30.87 ±3.23★☆B 組 16 92.50 ±18.54★△ 54.75 ±4.62★△☆C 組 16 78.63 ±17.45★△◇ 50.38 ±6.72★△◇☆D 組 16 117.63 ±26.51 78.13 ±9.11☆

表3 骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植對(duì)小鼠血清AST水平的影響(± s)Tab 3 The level of AST in the serum of mice after bone marrow mononuclear cells transplantation(± s)

表3 骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植對(duì)小鼠血清AST水平的影響(± s)Tab 3 The level of AST in the serum of mice after bone marrow mononuclear cells transplantation(± s)

★與D組比較，P＜0.05;△與A組比較，P＜0.05;◇與B組比較，P ＞0.05;☆與2周比較，P ＜0.05

組別 例數(shù)(只) AST值(U/L)2周 4周A 組 16 136.25 ±39.95★ 98.38 ±12.82★☆B 組 16 190.88 ±57.53★△ 134.38 ±37.70★△☆C 組 16 193.88 ±36.24★△◇115.25 ±13.94★△◇☆D 組 16 353.75 ±103.59 168.75 ±45.26☆

表4 骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植對(duì)小鼠血清ALB水平的影響(± s)Tab 4 The level of ALB in the serum of mice after bone marrow mononuclear cells transplantation(± s)

表4 骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植對(duì)小鼠血清ALB水平的影響(± s)Tab 4 The level of ALB in the serum of mice after bone marrow mononuclear cells transplantation(± s)

各組之間、各時(shí)間點(diǎn)之間比較，均P＞0.05

組別 例數(shù)(只) ALB值(g/L)2周 4周A組16 34.70 ±2.56 37.00 ±1.06 B 組 16 33.79 ±1.79 36.10 ±3.26 C 組 16 35.63 ±2.12 36.01 ±1.89 D組16 34.35 ±1.84 35.16 ±1.66

圖1 移植后2周肝臟冰凍切片圖像(200×);圖2 圖1所對(duì)應(yīng)的光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)(200×);圖3 移植后4周A組熒光圖片(200×);圖4 移植后4周B組熒光圖片(200×);圖5 移植后4周C組熒光圖片(200×);圖6 移植后4周D組熒光圖片(200×);圖7 急性肝損傷模型HE染色圖片(100×);圖8 急性肝損傷模型HE染色圖片(400×);圖9 移植后2周A組HE染色圖片(400×);圖10 移植后4周A組HE染色圖片(400×);圖11 移植后2周B組HE染色圖片(400×);圖12 移植后4周B組HE染色圖片(400×);圖13 移植后2周C組HE染色圖片(400×);圖14 移植后4周C組HE染色圖片(400×);圖15 移植后2周D組HE染色圖片(400×);圖16 移植后4周D組HE染色圖片(400×)Fig 1 The fluorescence staining positive cells of the liver 2 weeks after transplantation(200×);Fig 2 The optical microscope image of the liver corresponding to pictrue 1(200×);Fig 3 The fluorescence staining positive cells of the liver 4 weeks after transplantation(group A:200×);Fig 4 The fluorescence staining positive cells of the liver 4 weeks after transplantation(group B:200×);Fig 5 The fluorescence staining positive cells of the liver 4 weeks after transplantation(group C:200×);Fig 6 The fluorescence staining positive cells of the liver 4 weeks after transplantation(group D:200×);Fig 7 Micrographs of histological specimens of hepatic tissue 24 hours after treatment of CCl4(HE staining:100×);Fig 8 Micrographs of histological specimens ofhepatic tissue 24 hours after treatment of CCl4(HE staining:400×);Fig 9 Micrographs of histological specimens of hepatic tis-sue 2 weeks after transplantation(Group A ，HE staining:400×);Fig 10 Micrographs of histological specimens of hepatic tissue 4 weeks after transplantation(Group A，HE staining:400×);Fig 11 Micrographs of histological specimens of hepatic tissue 2 weeks after transplantation(Group B，HE staining:400×);Fig 12 Micrographs of histological specimens of hepatic tissue 4 weeks after transplantation(Group B，HE staining:400×);Fig 13 Micrographs of histological specimens of hepatic tissue 2 weeks after transplantation(Group C，HE staining:400×);Fig 14 Micrographs of histological specimens of hepatic tissue 4 weeks after transplantation(Group C，HE staining:400×);Fig 15 Micrographs of histological specimens of hepatic tissue 2 weeks after transplantation(Group D，HE staining:400×);Fig 16 Micrographs of histological specimens of hepatic tissue 4 weeks after transplantation(Group D，HE staining:400×)

3 討論

干細(xì)胞是具有自我更新、高度增生和多向分化潛能的細(xì)胞群體，特定條件下可以分化為不同的功能細(xì)胞，形成多種組織和器官。國(guó)內(nèi)外眾多試驗(yàn)表明［8］，無論是在生理還是在病理?xiàng)l件下，骨髓干細(xì)胞均可以分化為肝細(xì)胞。有研究證實(shí)［9］，在肝臟損傷的條件下，骨髓干細(xì)胞更易于定植于肝臟。其機(jī)制可能是肝損傷后機(jī)體產(chǎn)生了對(duì)肝再生有利的因子，例如:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞因子-4、干細(xì)胞因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1等。眾多實(shí)驗(yàn)表明［10］，這些刺激因子的介入可能加速了骨髓對(duì)肝細(xì)胞的誘導(dǎo)過程。

如何將干細(xì)胞高效率的誘導(dǎo)成肝細(xì)胞是目前亟待解決的問題。而細(xì)胞因子動(dòng)員干細(xì)胞的方式簡(jiǎn)單、無創(chuàng)，細(xì)胞因子的應(yīng)用逐漸成為干細(xì)胞移植領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［11］。干細(xì)胞因子(SCF)是一種重要造血細(xì)胞因子，它是酪氨酸激酶受體c-Kit的配體。SCF主要作用于早期造血干細(xì)胞、原始造血祖細(xì)胞，并且誘導(dǎo)這些細(xì)胞的存活、增殖和分化。作為骨髓干細(xì)胞的動(dòng)員劑，SCF是當(dāng)前國(guó)外研究的重點(diǎn)。SCF最初主要應(yīng)用于血液疾病的研究，近年來，許多研究者開始將其應(yīng)用于其他領(lǐng)域的治療，例如:心血管疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病等［12］。最近的研究表明［13］，SCF 在肝臟疾病中也發(fā)揮了很大的作用，SCF可以促進(jìn)肝再生。而G-CSF是眾所周知的外周血干細(xì)胞動(dòng)員劑，G-CSF可以通過動(dòng)員自體骨髓干細(xì)胞能夠促進(jìn)部分肝移植物的再生并且減少肝臟損傷［14］。研究表明，SCF單獨(dú)使用生物學(xué)作用低，但它與其他細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用具有很強(qiáng)的協(xié)同作用。SCF和G-CSF聯(lián)合使用，可使骨髓干細(xì)胞水平持續(xù)增高，比任何一種細(xì)胞因子單獨(dú)應(yīng)用增強(qiáng)，并且后續(xù)時(shí)間比單用G-CSF增加100倍［15］。

目前，對(duì)于細(xì)胞因子SCF和G-CSF在促進(jìn)肝再生方面的機(jī)制尚不明確，許多學(xué)者從細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)方面對(duì)SCF與G-CSF協(xié)同效應(yīng)的機(jī)理進(jìn)行了探討。Papayannopoulou等［16］認(rèn)為，SCF/c-kit可能是與動(dòng)員有關(guān)的一條共同途徑。而目前多數(shù)研究認(rèn)為，G-CSF和SCF的協(xié)同效應(yīng)依賴于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，而信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)可能是SCF與G-CSF受體下游信號(hào)互補(bǔ)途徑的一個(gè)關(guān)鍵元素［17］。STAT在造血細(xì)胞中是細(xì)胞因子信號(hào)傳遞的關(guān)鍵中介，借助于調(diào)節(jié)周期素依賴激酶(cdk)抑制劑P27Kip-1的表達(dá)來控制細(xì)胞的增殖［18］。Duarte 等［17］在對(duì) M07e-G 細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，G-CSF可以誘發(fā)STAT1/STAT3的酪氨酸磷酸化，使之激活。而SCF能夠誘發(fā)STAT3的ser727磷酸化，且在與G-CSF同用時(shí)可引起ser727最大程度的磷酸化(G-CSF+SCF較SCF引起ser727磷酸化的程度高54%)，ser727磷酸化可能有利于酪氨酸殘基已磷酸化的STAT3發(fā)揮最大轉(zhuǎn)錄活性［19］，增強(qiáng)STAT依賴基因的活性。G-CSF與SCF聯(lián)用引起的這一系列變化，表現(xiàn)為二者的協(xié)同增殖效應(yīng)。此外，還有實(shí)驗(yàn)證明［20］，MO7e-G細(xì)胞可用于鑒別這兩種細(xì)胞因子協(xié)同作用的關(guān)鍵之處(在擴(kuò)增和基因表達(dá)方面)。這兩種細(xì)胞因子通過下調(diào)p27kip1及使酪氨酸和絲氨酸殘基STAT3獨(dú)立磷酸化而在生化和分子水平產(chǎn)生作用。此外，在其他細(xì)胞因子如IL-17介導(dǎo)的粒細(xì)胞生成中，也證實(shí)需要G-CSF及SCF的協(xié)同作用［21］。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究SCF和G-CSF聯(lián)合應(yīng)用對(duì)骨髓干細(xì)胞向急性肝損傷小鼠肝臟遷移的影響，并觀察二者的應(yīng)用是否可以加快受損肝臟的修復(fù)。目前雖有二者聯(lián)合應(yīng)用的報(bào)道，但在促進(jìn)骨髓干細(xì)胞修復(fù)急性肝損傷方面鮮有報(bào)道。這是本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)。

在實(shí)驗(yàn)中，選擇近交系BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用其遺傳相似性的特點(diǎn)，可看做是自體骨髓移植，這就避免了細(xì)胞移植過程中的免疫排斥反應(yīng)等問題。

PKH26是一種標(biāo)記細(xì)胞膜的帶有長(zhǎng)脂肪族末端的紅色熒光染料，它可以與細(xì)胞膜上的脂類區(qū)域穩(wěn)定結(jié)合，在551 nm激發(fā)光下可發(fā)出波長(zhǎng)為567 nm的紅色熒光，在熒光顯微鏡下即可觀察標(biāo)記的細(xì)胞。PKH26具有染色速度快，染色均勻，且性質(zhì)穩(wěn)定，無細(xì)胞毒作用，熒光衰減慢等特點(diǎn)，因此，是干細(xì)胞研究中常用的細(xì)胞標(biāo)記物［22］。本實(shí)驗(yàn)選用PHK26紅色熒光染料作為骨髓單個(gè)核細(xì)胞的示蹤劑，經(jīng)體外染色后輸入小鼠體內(nèi)進(jìn)行追蹤，在熒光顯微鏡下，可觀察到小鼠肝臟冰凍切片中有散在紅色熒光標(biāo)記，表明體外經(jīng)PKH26標(biāo)記的骨髓單個(gè)核細(xì)胞可以遷移至肝臟。并且通過計(jì)數(shù)冰凍切片中PKH26標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，比較SCF和G-CSF對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的動(dòng)員作用，從而為觀察二者的協(xié)同作用提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SCF和G-CSF聯(lián)合應(yīng)用比二者單獨(dú)應(yīng)用確實(shí)能更好的改善肝功，加快受損肝臟的修復(fù)。其具體機(jī)制不清，可能與促進(jìn)了骨髓干細(xì)胞向受損肝臟的遷移及分化有關(guān)，也可能促進(jìn)了肝臟內(nèi)源性修復(fù)有關(guān)?？傊呗?lián)合應(yīng)用加快了受損肝臟的修復(fù)，為終末期肝病的治療帶來了新的希望。

雖然骨髓干細(xì)胞具有廣闊的應(yīng)用前景，但是還有許多爭(zhēng)論性的問題沒有解決，如何有效地獲得大量同質(zhì)性的骨髓干細(xì)胞，有待于對(duì)其細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)和異質(zhì)細(xì)胞群中各類細(xì)胞標(biāo)志物的進(jìn)一步研究。揭示干細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制的研究，干細(xì)胞移植的免疫問題，影響干細(xì)胞移植成功的因素都是有待深入研究和亟待解決的問題。盡管如此，由于骨髓干細(xì)胞具有公認(rèn)的多向分化性，被認(rèn)為是一種理想的細(xì)胞治療和基因治療的靶細(xì)胞，相信隨著研究的進(jìn)一步深入，一定會(huì)為其臨床應(yīng)用帶來新的前景。

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Effects of stem cell factor(SCF)and granulocyte colony stimulating factor(G-CSF)on the transplantation of bone marrow mononuclear cells(BMMCs)for the treatment of acute liver failure

FANG Xia，HAN Mingzi，ZHANG Min，JIN Shizhu，WANG Hongliang
Department of ICU，the second Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086，China

ObjectiveTo explore the amount of bone marrow mononuclear cells migrating to the liver during grafting in mice，and the effects on liver function.MethodsFirst，prepared acute liver failure model using CCl4/2-AAF，then，BMMCs(labeled with PKH26 before transplantation)were infused into the caudal veins of different mice with homogeneity and hypodermic inject SCF，G-CSF simultaneously.All the mice were divided into 4 groups randomly:group A:SCF+G-CSF and group B:SCF，group C:G-CSF and group D:control treatment.2 weeks and 4 weeks after transplantation，the values of ALT，AST and ALB were assessed，the status of grafting cells and the histological assessment of the liver were studied.Results(1)The PKH26 labeled cells:group A ＞group C＞group B and group D.Compared with group A ，there was significant difference(P ＜0.05);(2)Histological finding of the liver:group A was better than others;(3)The levels of ALT，AST and ALB:compared with group A，there were significant differences in ALT，AST(P ＜0.05)，but there was no difference in ALB between them(P ＞0.05).Compared with 2 weeks after transplantation，there was significant difference(P ＜0.05).Conclusion(1)SCF and G-CSF can promote migration of BMMCs to the liver in mice with acute injury，and accelerate the liver regeneration;(2)SCF combined with G-CSF are more effectively protect the liver than single use.

Stem cell factor;Granulocyte colony stimulating factor;Bone marrow mononuclear cells;Acute liver failure;Transplantation

R571

A

1006－5709(2012)11－1037－06

2012-08-20

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.11.015

房霞，碩士研究生，研究方向:干細(xì)胞移植與肝臟再生。E-mail:afang919@163.com

韓明子，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向:干細(xì)胞移植與肝臟再生。E-mail:hanmingzi@163.com