朱格非 麥 慧* 張 馳 傅麗清 滕曉顰

(1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院整形外科，南寧市 530021;2新西蘭奧克蘭大學(xué)化學(xué)科學(xué)學(xué)院，奧克蘭市 1142)

丙烯酰胺單體對人肝細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究▲

朱格非1麥 慧1*張 馳2傅麗清1滕曉顰1

(1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院整形外科，南寧市 530021;2新西蘭奧克蘭大學(xué)化學(xué)科學(xué)學(xué)院，奧克蘭市 1142)

目的探討丙烯酰胺單體(acrylamide，AA)對體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞株(L-02)的生長抑制作用。方法MTT比色法測定不同時間段、不同濃度AA對L-02細(xì)胞的生長抑制率，并設(shè)對照組，繪制生長抑制曲線。結(jié)果經(jīng)不同濃度(0.625%、1.25%、2.5%、5%、10%、20%)的 AA作用24 h、48 h、72 h后，與對照組比較，L-02生長抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。AA對L-02細(xì)胞均有明顯毒性，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖抑制作用。結(jié)論AA對體外培養(yǎng)的L-02細(xì)胞具有增殖抑制作用，且呈時間劑量依賴性。

丙烯酰胺;肝細(xì)胞;細(xì)胞毒性;MTT法

聚丙烯酰胺水凝膠被證實(shí)無毒性［1］，曾被整形美容醫(yī)師大量應(yīng)用于注射隆乳，但用于注射隆乳后，仍出現(xiàn)大量術(shù)后并發(fā)癥，如感染、局部疼痛等［2～5］，眾多學(xué)者對注射隆乳后并發(fā)癥的原因進(jìn)行了廣泛的探討和研究。以往的動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)丙烯酰胺單體具有腎毒性，但尚未見其在細(xì)胞學(xué)水平對肝毒性的相關(guān)研究報道。為此本研究以人肝細(xì)胞株L-02作為工具細(xì)胞，丙烯酰胺單體作用后，MTT比色法檢測其對L-02細(xì)胞是否具有增殖抑制作用。

1 材料和方法

1.1 受試材料 丙烯酰胺單體(acrylamide，AA MW 71.08，瑞興科技有限公司)。細(xì)胞株:人正常肝細(xì)胞株(L-02)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。主要試劑:RPMI-1640培養(yǎng)液(賽默飛世爾生物化學(xué)制品公司)，小牛血清(Gibco公司)，磷酸緩沖鹽PBS(索萊寶公司)，溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT，索萊寶公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，胰蛋白酶(博士德公司)。儀器設(shè)備:倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scien)，超凈工作臺(上海力申科學(xué)儀器公司)，電子分析天平(蘇州四海醫(yī)療器械有限公司)，氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠)，全自動酶標(biāo)分析儀(山東高密彩虹分析儀器公司)。

1.2 藥物配制 分析天平精確稱量AA，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，配制成50%溶液常溫避光備用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) L-02細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、濕度95%條件下靜置培養(yǎng)。細(xì)胞生長到80%后，加入1 mL消化液(含0.02%EDTA，0.25%胰蛋白酶)消化，待細(xì)胞變圓，間隙增大時，棄消化液，注入培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，1/3比例傳代，每3～4 d傳代一次。

1.4 AA對L-02細(xì)胞的毒性作用 采用MTT比色法，取對數(shù)生長期的L-02細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化、吹打分散后計(jì)數(shù)，配制為細(xì)胞密度為8×104/mL的細(xì)胞懸液，每孔100 uL接種于96孔板中，分別設(shè)置24 h、48 h、72 h培養(yǎng)板。每板分別設(shè)有不同劑量藥物組、陰性對照組、空白組，每組3個復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，棄去舊的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，將AA溶液加入相應(yīng)各孔，終濃度分別為0.625%、1.25%、2.5%、5%、10%、20%。藥物作用細(xì)胞 24 h、48 h、72 h 后，取出培養(yǎng)板，每孔加入5 mg/mL的MTT10 μL，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀測每孔光密度(optical density，OD)值，波長490 nm，按以下公式計(jì)算抑制率:

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，各組間的比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

不用劑量AA作用24 h、48 h、72 h后，對體外培養(yǎng)的L-02均有抑制作用，隨著AA濃度的增加，細(xì)胞OD值逐步降低，表示細(xì)胞受到明顯的抑制和破壞。其抑制率呈現(xiàn)明顯劑量依賴關(guān)系，隨著藥物劑量增大，其對細(xì)胞的生長抑制越強(qiáng)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，藥物作用24 h、48 h、72 h時，不同濃度AA對L-02的生長抑制與陰性對照組OD值的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而藥物作用48 h后，AA在濃度為0.625%時，較24 h對L-02生長抑制率增加，但組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。藥物作用72 h后，AA在各濃度對L-02的生長抑制率均高于90%。見表1、圖1。

表1 AA 24 h、48 h、72 h對L-02細(xì)胞的生長抑制效應(yīng) (±s，n=3)

表1 AA 24 h、48 h、72 h對L-02細(xì)胞的生長抑制效應(yīng) (±s，n=3)

注:各組生長抑制率與陰性對照組比較:*P ＜0.05，#P ＜0.01。

藥物濃度V(%)(μmol/L)24 h OD值 抑制率(%)48 h OD值 抑制率(%)72 h OD值 抑制率(%)0.625(0.012) 0.245 ±0.024 60.65%* 0.125 ±0.015 78.75%# 0.078 ±0.015 93.87%#1.25(0.023) 0.204 ±0.027 67.24%* 0.089 ±0.016 84.83%# 0.074 ±0.060 94.13%#2.5(0.046) 0.146 ±0.044 76.50%# 0.075 ±0.023 87.16%# 0.067 ±0.062 94.71%#5(0.093) 0.131 ±0.052 78.96%# 0.080 ±0.009 86.31%# 0.072 ±0.064 94.34%#10(0.185) 0.113 ±0.076 81.91%# 0.093 ±0.004 84.09%# 0.085 ±0.067 93.26%#20(0.370) 0.062 ±0.144 90.10%# 0.057 ±0.010 90.34%# 0.066 ±0.005 94.81%#陰性對照組0.623 ±0.052 － 0.587 ±0.046 － 1.266 ±0.069 －

圖1 不同時間段AA對L-02細(xì)胞的生長抑制率

3 討論

醫(yī)用填充材料置入人體后，需同體液相接觸，聚丙烯酰胺水凝膠(polyacrylamide hydrogel，PAAG)作為高聚合材料，已被廣泛證實(shí)對人體無明顯毒性。國內(nèi)外多位學(xué)者的研究報道認(rèn)為，PAAG是無毒、無過敏、無致畸、無胚胎毒性、無突變和無降解的，注射入人體后形態(tài)自然［6，7］。1997年該產(chǎn)品引入中國后，開始大量應(yīng)用于注射隆胸或其他軟組織填充，2000年開始出現(xiàn)多個案例的術(shù)后并發(fā)癥的報道，主要為急性或無菌性炎癥、疼痛、局部腫脹、紅腫、穿破或竇道形成等，且注射物易于向組織間隙滲漏。2006年4月30日國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)文全面停止了生產(chǎn)、銷售和使用PAAG(注射用)。

目前聚丙烯酰胺水凝膠注射隆乳后產(chǎn)生術(shù)后并發(fā)癥的原因尚未完全清楚。聚丙烯酰胺是無毒的，但其單體并不能完全聚合，殘留的AA是有毒的，由此可以推斷聚丙烯酰胺這類聚合物是否有毒，以及毒性程度，應(yīng)取決于AA的殘留量。因此國內(nèi)外眾多學(xué)者將目光聚焦于人體內(nèi)單體殘留量，大量文獻(xiàn)報道對注射治療后的患者進(jìn)行體內(nèi)單體檢測，亦未得出明確結(jié)論［8］。

通過本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AA對人正常肝細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用。藥物作用24 h、濃度為0.625%的AA對L-02細(xì)胞的生長抑制率即達(dá)到了60.65%，濃度為20%的AA的細(xì)胞生長抑制率達(dá)到68.75%，與對照組的差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥物作用48 h、濃度為0.625%的AA對細(xì)胞的生長抑制率達(dá)到78.75%，與對照組的OD值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，20%的藥物濃度細(xì)胞生長抑制率達(dá)90.34%。藥物作用72 h、0.625%的藥物濃度細(xì)胞生長抑制率為93.87%，20%的藥物濃度細(xì)胞生長抑制率達(dá)94.81%。AA對L-02細(xì)胞的生長抑制率呈現(xiàn)了明顯的時間劑量正相關(guān)，隨著藥物劑量增大、藥物作用時間延長，其對細(xì)胞的生長抑制作用越強(qiáng)，具有明顯的細(xì)胞毒性。

由此可見，醫(yī)用聚合物材料置入人體內(nèi)后，同體液相接觸，該聚合物本身沒有毒性，引起炎癥和組織反應(yīng)的主要原因是聚合物中的易溶出物質(zhì)，這些易溶出物質(zhì)一般包括殘留的原料單體及該高聚物內(nèi)的其他添加劑等等［9］。本研究通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)證實(shí)了AA對L-02具有明顯的毒性作用，但也只能反映出PAAG溶出物的毒性情況，但要定量地考察出聚合物溶出物對生物的影響則是比較困難的。國內(nèi)有學(xué)者對聚丙烯酰胺水凝膠注射隆乳患者的注射物中進(jìn)行丙烯酰胺單體提取，AA提取量均明顯小于未植入體內(nèi)的聚丙烯酰胺水凝膠中單體最低檢出量［10］。也就是說在注射人體內(nèi)后，AA在注射區(qū)域的含量明顯小于未植入人體前的檢出量。此類結(jié)果無明顯實(shí)際意義，因?yàn)榫郾０匪z中的水分在人體組織復(fù)雜的生物環(huán)境中與體液進(jìn)行交換，且AA具有水溶性，其可以自由擴(kuò)散，被組織吸收、代謝使之含量減少，對注射部位AA含量的檢測尚不能代表AA對人體的毒性強(qiáng)弱，因此這需要了解注射隆乳的患者術(shù)后一定時間內(nèi)血液中單體的含量，并對血液中的AA含量的檢測方法進(jìn)行探索，并分析這些濃度的溶出物是否會對人體造成毒性反應(yīng)。AA進(jìn)入體內(nèi)后，廣泛分布于體液，并可以通過母體進(jìn)入胎兒體內(nèi)，其在人體內(nèi)會產(chǎn)生一系列代謝反應(yīng)。體內(nèi)的丙烯酰胺主要與谷胱甘肽結(jié)合，反應(yīng)生成N-醋酸基-S-半胱氨酸，通過其他生物轉(zhuǎn)化途徑產(chǎn)生N-甲基丙烯酰胺和N-異丙基丙烯酰胺，最后從尿液中大量排出，丙烯酰胺及其代謝產(chǎn)物可以與血紅蛋白結(jié)合，能聚集在神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎及生殖系統(tǒng)［11］。

綜上所述，我們需要建立大樣本大型哺乳動物模型，在動物模型身上進(jìn)行模擬手術(shù)，注射一定劑量聚丙烯酰胺水凝膠，喂養(yǎng)一定時間后分不同時間段抽取血液進(jìn)行AA的檢測，了解AA在動物體內(nèi)含量變化并進(jìn)行分析，這將是今后研究的重點(diǎn)。

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Study on anti-proliferation effect of acrylamide on human hepatocyte in vitro

ZHU Ge-fei1，MAI Hui1* ，ZHANG Chi2，F(xiàn)U Li-qing1，TENG Xiao-pin1(1.Department of Plastic Surgery，The People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530021，Guangxi，China;2.School of Chemical Science，the University of Auckland，Auckland 1142，New Zealand)

ObjectiveTo explore the growth-inhibition effect of acrylamide(AA)on human hepatocyte L-02 in vitro.Method Method The growth-inhibition rate of L-02 of different concentration of AA in different time section were tested by MTT method，with L-02 cultured with medium free of AA as control group.Anti-proliferation curves were drawn.Result The anti-proliferation rate of L-02 of different concentration of AA(0.625，1.25，2.5，5，10，20%)in different time section(24h，48h，72h)was different to that of the control(P ＜0.05).AA was showed with apparent cytotoxicity of cytostasis.ConclusionAA has a function of anti-proliferation on L-02 in vitro，and it increases with both time and dose.

Acrylamide;Human hepatocyte;Cytotoxicity;MTT method

R 318.08

A

1673-6575(2012)06-0584-04

廣西科學(xué)基金(編號:桂科自0991210)

朱格非(1981～)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向:軟組織修復(fù)與重建。*

2012-10-11

2012-11-16)