王 琪，樸豐源

(1. 中國醫(yī)科大學(xué) 96期臨床醫(yī)學(xué)班，遼寧 沈陽 110001；2. 大連醫(yī)科大學(xué) 勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

砷是一種廣泛存在的環(huán)境污染物。急、慢性砷暴露可導(dǎo)致生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚等多組織器官的損害，嚴(yán)重危害人類的健康。近年來，砷對(duì)男性生殖系統(tǒng)的毒性作用備受關(guān)注[1-2]。Hsieh等[1]通過流行病學(xué)調(diào)查和臨床觀察發(fā)現(xiàn)砷對(duì)男性生殖系統(tǒng)有一定的毒性作用。Chiou等[2]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)砷可損害實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的精子生成功能，導(dǎo)致雄性生殖系統(tǒng)功能異常。以上文獻(xiàn)均提示，男性生殖系統(tǒng)可能是砷毒性作用的主要靶器官之一，但其毒作用機(jī)制并不十分清楚。目前認(rèn)為編碼于Y染色體的性基因參與調(diào)節(jié)雄性生殖功能。本課題組在近期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，砷暴露顯著影響一些性基因的表達(dá)[3-4]。Eif2s3y是Y染色體性基因，不僅在雄性生殖系統(tǒng)中表達(dá)，在腦組織中也有高表達(dá)，與精子的發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)[5-6]。因此，本研究就亞慢性砷暴露對(duì)雄性小鼠腦組織Eif2s3y表達(dá)影響進(jìn)行觀察，以便為探討砷的雄性生殖毒作用機(jī)制提供靶基因依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

三氧化二砷(As2O3)；TRIzol 試劑盒(美國Invitrogen公司)；RNeasy Mini Kit(德國OIAGEN公司)； DEPC-Water (美國Ambion公司)； Herring Sperm DNA (美國Promega公司); BSA(美國Invitrogen公司); MOPS (上海Sagon公司); β-Mercaptoethanol (上海Sagon公司); Normal Goat IgG (美國Sigma公司)； 氯仿(天津市福晨化學(xué)試劑廠)；異丙醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；乙醇(沈陽新興試劑廠)；TRNzol-A+總RNA提取試劑(天根生化科技有限公司)；Quant cDNA 第一鏈合成試劑合(天根生化科技有限公司)；2×Taq PCR MasterMix(天根生化科技有限公司)。

1.2 設(shè) 備

GeneArrayTM掃描儀3000(Affymetrix公司)；全自動(dòng)芯片洗滌工作站450 (Affymetrix公司)；基因芯片雜交箱640(Affymetrix公司)；Microarray Suite Version 5.0分析軟件(Affymetrix公司)等；754紫外可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)； PCR儀(Thermo Electron Co,美國)；UVP凝膠電泳拍攝分析系統(tǒng)(美國UVP公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

SPF級(jí)雄性小鼠30只，體重(20±2)g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按體重將小鼠隨機(jī)分為3組，即生理鹽水對(duì)照組、低劑量組染砷組(1 mg/L As2O3和高劑量組染砷組(4 mg/L As2O3)，每組10只。小鼠正常飲食，通過自然飲用含不同濃度As2O3蒸餾水的方式使小鼠染毒，連續(xù)染毒60 d。染毒結(jié)束后，將小鼠斷頭處死并立即取腦儲(chǔ)存于RNA lazer 液中，低溫保存。

1.4 總RNA的提取和基因芯片雜交

分別將各實(shí)驗(yàn)組(1 mg/L和4 mg/L As2O3)和對(duì)照組的小鼠大腦和小腦在液氮中進(jìn)行研磨，依TRIzol 試劑盒操作說明從腦組織中抽提總RNA，用RNeasy Mini Kit進(jìn)行純化。提取的RNA在紫外分光光度儀下測(cè)定RNA的濃度和純度，同時(shí)變性膠電泳檢測(cè)RNA有無降解；然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA探針，合成的同時(shí)進(jìn)行生物素標(biāo)記；生物素標(biāo)記的cRNA探針經(jīng)片段化處理后與Mouse Genome 430 2.0 Araay基因芯片在雜交箱640中45℃雜交16 h，然后于全自動(dòng)芯片洗滌工作站450中洗脫、染色；最后用GeneArrayTM 掃描儀3000掃描雜交信號(hào)。

1.5 芯片數(shù)據(jù)處理和生物學(xué)信息分析

雜交結(jié)果用Affymetrix公司的Microarray Suite Version 5.0軟件進(jìn)行分析。在對(duì)單個(gè)樣本表達(dá)分析的前提下，根據(jù)P<0.04為表達(dá)，0.04～0.06為臨界，P>0.06為不表達(dá)，分別建立對(duì)照組、低劑量染砷組，高劑量染砷組腦組織的基因表達(dá)譜；然后將二者的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，根據(jù)signal log ratio (SLR)值判斷。SLR>1(即表達(dá)倍數(shù)>21)為表達(dá)上調(diào)，SLR<-1(即表達(dá)倍數(shù)<2-1)為表達(dá)下調(diào)，篩選得到在對(duì)照組、低劑量染砷組，高劑量染砷組中差異表達(dá)的基因探針號(hào)輸入NetAffy網(wǎng)站(www.affymetrix.com)中進(jìn)行批量處理查詢(Batch Query)，查詢出相對(duì)應(yīng)的基因和生物學(xué)信息。

1.6 RT-PCR

按試劑盒說明提取總RNA。RT- PCR 反應(yīng)條件為，Eif2s3y為: 94℃變性3 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸7 min；β-actin：94 ℃變性3 min,94℃變性30 s,58 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸7 min。 RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)照相。同β-actin比較。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)Tab1 Primer design

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。用方差和LSD檢驗(yàn)分析PCR檢測(cè)的mRNA表達(dá)相對(duì)值的多組間差異,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 染砷組小鼠腦組織Eif2s3y基因芯片篩選結(jié)果

在小鼠大腦和小腦中，與對(duì)照組比較，高劑量染砷組和低劑量染砷組Eif2s3y基因表達(dá)均上調(diào)。見表2。

表2 染砷小鼠腦組織Eif2s3y基因表達(dá)的芯片結(jié)果

與對(duì)照組比較，染砷組小鼠腦組織基因表達(dá)顯著上調(diào)(表達(dá)倍數(shù)>2)。

2.2 染砷小鼠大腦皮質(zhì)Eif2s3y的 RT-PCR結(jié)果

與對(duì)照組比較，染砷小鼠大腦皮質(zhì)Eif2s3y的mRNA表達(dá)量隨染砷濃度的增高而增加，尤其4 mg/L染砷組Eif2s3y表達(dá)最為明顯。β-Actin作為內(nèi)參(圖1)。

2.3 染砷小鼠大腦髓質(zhì) Eif2s3y的 RT-PCR結(jié)果

染砷小鼠大腦髓質(zhì)Eif2s3y的mRNA表達(dá)量均比對(duì)照組增加，尤其4 mg/L染砷組Eif2s3y表達(dá)最為明顯。β-Actin作為內(nèi)參(圖2)。

2.4 染砷小鼠小腦Eif2s3y的 RT-PCR結(jié)果

染砷小鼠小腦Eif2s3y的 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較，無明顯變化。β-Actin作為內(nèi)參(圖3)。

圖1 小鼠大腦皮質(zhì)Eif2s3y的mRNA表達(dá)

圖2 小鼠大腦髓質(zhì)Eif2s3y的mRNA表達(dá)

圖3 小鼠小腦Eif2s3y的mRNA表達(dá)

3 討 論

砷可通過血液和腦脊液進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)而損傷腦組織[7]，導(dǎo)致腦功能失調(diào)而引起一系列的臨床表現(xiàn)。腦不僅調(diào)節(jié)機(jī)體的記憶和行為功能還參與調(diào)節(jié)機(jī)體的生殖功能。丘腦-垂體-睪丸軸調(diào)節(jié)著男性激素水平和生殖功能[8]。通過下丘腦-垂體-性腺軸的反饋及負(fù)反饋?zhàn)饔脕碚{(diào)節(jié)內(nèi)分泌激素，使外周激素的水平保持相對(duì)穩(wěn)定，而外周激素的水平保持相對(duì)穩(wěn)定對(duì)維持男性生殖功能的正常是一個(gè)重要因素。最近研究表明性基因在腦中表達(dá)也參與調(diào)節(jié)機(jī)體的外周性激素的水平。Y染色體基因表達(dá)雄性遺傳信息，參與調(diào)節(jié)雄性動(dòng)物內(nèi)分泌和行為等功能。Eif2s3y是在雄性動(dòng)物腦中表達(dá)的主要Y染色體基因， 其編碼的蛋白參與調(diào)節(jié)雄性生殖功能[9]。本研究的基因芯片結(jié)果顯示，砷暴露雄性小鼠大腦皮質(zhì)Eif2s3y基因的表達(dá)增多。且RT-PCR結(jié)果也顯示，砷暴露雄性小鼠大腦皮質(zhì)和髓質(zhì)Eif2s3y的mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組。本研究結(jié)果表明，亞慢性砷暴露可能顯著上調(diào)Eif2s3y基因在雄性小鼠大腦組織的表達(dá)。而砷暴露小鼠小腦組織，其Eif2s3y的mRNA表達(dá)在基因芯片結(jié)果顯示明顯高于對(duì)照組。但RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較砷暴露雄性小鼠小腦組織Eif2s3y的mRNA表達(dá)沒有顯著增多。對(duì)于這兩種基因表達(dá)檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)果的不一致，可能需要用更精確的實(shí)時(shí)定量PCR加以確認(rèn)。

Eif2s3y很可能是砷雄性生殖毒性作用的一個(gè)靶基因。今后有必要進(jìn)一步從蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證亞慢性染砷對(duì)大腦組織Eif2s3y表達(dá)的影響，同時(shí)通過一系列干預(yù)實(shí)驗(yàn)探討砷對(duì)小鼠腦組織Eif2s3y基因表達(dá)的影響與小鼠雄性生殖功能異常之間的因果關(guān)系是非常必要的。

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