蒙兆年

(寧夏師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院 寧夏固原 756000)

本實(shí)驗(yàn)利用自行配制的染液，通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行整塊組織H.E染色制片。此法制成的切片染色效果較好，色彩更加均勻。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)所用切片石蠟、羊肝臟、載玻片、蓋玻片、醫(yī)用酒精、福爾馬林溶液、蘇木素液、伊紅染液、二甲苯、蒸餾水等。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 德國(guó)徠卡2016超薄切片機(jī)、YB－6型生物組織石蠟包埋機(jī)、DK－型電熱恒溫水槽、泰斯特電熱恒溫培養(yǎng)箱、45角式系列臺(tái)式低速離心機(jī)、YT－6C型生物組織攤烤片機(jī)、YTG－5E型生物組織處理多用機(jī)等儀器。

2 方法

2.1 染色液的配制 ①蘇木素染色液。配制成分:蘇木素染色劑15mg，蒸餾水40mL，鉀明礬600mg，碘酸鈉5mg，將4種藥品混合，每次染色現(xiàn)用現(xiàn)配。②新型伊紅配制染液。配制成分:伊紅R250mg，95%酒精50mL，蒸餾水50mL，冰醋酸少許。配制過(guò)程:現(xiàn)將250mg伊紅溶液溶于蒸餾水2mL中，溶解后將冰醋酸一滴一滴加入其中，在滴冰醋酸的過(guò)程中邊滴邊攪動(dòng)，這時(shí)可見(jiàn)沉淀形成，接著再往液體中加入蒸餾水2mL。繼續(xù)等冰醋酸至沉淀不再增強(qiáng)為止。然后過(guò)濾將所沉淀的物質(zhì)置于50°～60°干燥箱中烤干，烤干后將沉淀物溶于50mL的95%酒精中即成。此法配制的伊紅染液也是邊用邊配，以保持所配液體的新鮮和成分的純度性。

2.2 操作步驟 ①固定:整塊組織進(jìn)行固定時(shí)可用BOUIN液或福爾馬林等進(jìn)行固定，固定的時(shí)間一般為36小時(shí)左右。因?yàn)檎麎K組織進(jìn)行染色時(shí)所取材組織塊大，因而固定的時(shí)間也要長(zhǎng)。這樣就可充分保證固定液滲透到組織塊中，達(dá)到固定的目的，對(duì)成分進(jìn)行保護(hù)，更好地保證了制作切片的質(zhì)量。②浸洗:將固定后的組織塊按常規(guī)的方法放入蒸餾水中進(jìn)行浸洗。③染蘇木素液:將浸洗后的組織塊與染液按1:6的比例進(jìn)行浸洗染色。染色時(shí)間應(yīng)該考慮取材的組織塊的大小和氣溫高低。一般情況下整塊組織染色的時(shí)間較長(zhǎng)，需要4小時(shí)左右。④浸洗分色:可用蒸餾水進(jìn)行浸洗。在浸洗的過(guò)程中每1～2小時(shí)可置換一次蒸餾水，直到不再有余色溢出為止。浸洗的時(shí)間一般要4小時(shí)左右，這時(shí)組織塊表面呈現(xiàn)紫紅色。⑤藍(lán)化:接著將組織塊放在容器中用自來(lái)水沖洗4小時(shí)左右，然后放置2小時(shí)，再更換一次自來(lái)水，再放置2小時(shí)。處理后的組織塊呈現(xiàn)藍(lán)色。⑥梯度濃度酒精脫水:將經(jīng)過(guò)上述步驟處理后的石蠟組織塊經(jīng)70%、80%、90%酒精進(jìn)行脫水。⑦伊紅染色:在自制的伊紅酒精染液中浸染約2小時(shí)左右，材料與染液的比例也按1:6的比例進(jìn)行染色。⑧鹽酸酒精進(jìn)行分色:將伊紅染色后的組織塊經(jīng)過(guò)95%酒精進(jìn)行分色大約1分鐘左右。⑨純酒精進(jìn)行脫水:將鹽酸酒精分色后的組織塊經(jīng)100%純酒精進(jìn)行脫水1小時(shí)左右。⑩二甲苯透明:將脫水后的石蠟組織經(jīng)二甲苯進(jìn)行透明，以便除去組織中的雜質(zhì)成分?！?1石蠟組織包埋:將石蠟放進(jìn)裝有經(jīng)過(guò)上述途徑制作的石蠟組織塊中，進(jìn)行包埋。○12切片:將包埋后的石蠟組織塊用超薄切片機(jī)將通過(guò)以上各種途徑制作的石蠟組織切片切成5～8μm厚的切片。后續(xù)其他制作程序與傳統(tǒng)石蠟組織切片制作程序無(wú)異。以上就是整塊組織H.E染色制作切片法的步驟。

3 實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)的改變

整塊組織H.E染色制片，有別于傳統(tǒng)石蠟切片單片片染制作法，從操作步驟上來(lái)說(shuō)，主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了改變。

3.1 染色時(shí)間的改變 傳統(tǒng)石蠟單片片染制作時(shí)蘇木精染色的時(shí)間是5～10分鐘左右;伊紅染色的時(shí)間是3～5分鐘左右;而整塊組織H.E染色時(shí)間制作者經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)后，認(rèn)定為在蘇木精染液中需4小時(shí)為最佳;在伊紅染液中需2小時(shí)為最佳，因?yàn)槿绻旧珪r(shí)間太短的話(huà)，染液就不能很好地滲透到組織材料內(nèi)部，經(jīng)過(guò)以上時(shí)間段的染色后，效果就很好了。

3.2 氣溫對(duì)染色的影響 氣溫對(duì)染色的效果有一定的影響。染色時(shí)氣溫不合適，可能會(huì)導(dǎo)致制片所使用的染液出現(xiàn)變性、凝固、沉淀等現(xiàn)象。所以在整塊組織H.E染色制作切片的過(guò)程中，制作時(shí)周?chē)鷾囟忍突蛱叨疾恍?，一般要使用的最佳溫度?5～30℃為最佳，如果周?chē)鷾囟冗_(dá)不到這個(gè)要求，制作者就應(yīng)該將所取材制作的組織材料放置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，以便保持染色時(shí)的溫度恒定，從而達(dá)到最佳的染色效果。

3.3 酒精分色時(shí)間的調(diào)整 傳統(tǒng)石蠟組織單片片染制作時(shí)用鹽酸酒精分色一般在10秒左右。整塊組織H.E染色制片在使用鹽酸酒精分色時(shí)，因?yàn)樗〔牡慕M織塊比較大，分色時(shí)間用10秒左右，顯然是不行的，這時(shí)應(yīng)將時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)。一般使用95%酒精分色1分鐘為最佳，這樣做就可以讓內(nèi)部的組織更好地進(jìn)行分色。

3.4 蘇木精染色后蒸餾水浸洗程度的控制 因?yàn)榻闯潭冗_(dá)不到要求，細(xì)胞核就會(huì)呈現(xiàn)一團(tuán)紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)也會(huì)染上深藍(lán)色。這樣在制片的過(guò)程中就會(huì)惡性循環(huán)，影響伊紅的染色。制作者用蒸餾水進(jìn)行浸洗，每1～2小時(shí)換一次蒸餾水，這樣一直保持操作下去，到不再有余色溢出為止。蘇木精染色后浸洗的時(shí)間一般需4小時(shí)左右，這時(shí)組織塊呈現(xiàn)紫藍(lán)色，就會(huì)達(dá)到所制作的要求。

3.5 實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵程序的調(diào)整 石蠟組織整塊H.E染色切片制作法與傳統(tǒng)石蠟組織切片片染制作法的關(guān)鍵區(qū)別是對(duì)取材組織染色時(shí)間的調(diào)整，整塊組織H.E染色制作切片法是將所取材的組織染色時(shí)間改變?cè)诮M織包埋切片之前進(jìn)行。當(dāng)組織切片后就不再染色，直至貼片至封固，從而成片。

4 討論

4.1 組織染色均勻，色彩更加鮮艷 只要制作者在制作的過(guò)程中，把握好染色時(shí)間，染色時(shí)就不會(huì)出現(xiàn)外深內(nèi)淺的染色現(xiàn)象。常用的酸性染料伊紅染色所顯示出來(lái)的紅色和堿性染料蘇木素染色顯示的藍(lán)色從色澤對(duì)比上來(lái)說(shuō)更加鮮艷，在顯微鏡下的觀(guān)察效果會(huì)更好。

圖1 整塊組織H.E染色制作切片法與傳統(tǒng)切片單片片染制作法的結(jié)構(gòu)染色效果對(duì)比圖(取材:羊肝臟)

由圖1不難看出，整塊組織H.E染色制作法制作出來(lái)的切片比傳統(tǒng)石蠟組織切片單片片染制作出來(lái)的切片染色效果更好，其組織染色更加均勻，色彩更加鮮艷，與傳統(tǒng)制作法相比，并無(wú)明顯的組織結(jié)構(gòu)差異。制作者在染色時(shí)一定要把握好染色的時(shí)間，染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)導(dǎo)致染色效果不佳。蘇木精染色的時(shí)間一般是4小時(shí)，伊紅染色的時(shí)間一般是2小時(shí)。而且進(jìn)行整塊組織染色過(guò)程中常用的將堿性染料蘇木素染色顯示的藍(lán)色和用酸性染料將伊紅顯示的紅色二者相比色澤更加鮮艷，在顯微鏡下的觀(guān)察效果會(huì)更好。

4.2 節(jié)省制作者的時(shí)間及精力 整塊組織H.E染色制作時(shí)可同時(shí)浸染數(shù)個(gè)不同器官系統(tǒng)的組織塊，為制作者節(jié)省大量的時(shí)間及精力，是制作大量生物醫(yī)學(xué)教學(xué)切片的首選方法。制作出來(lái)的教學(xué)切片成功效率高。無(wú)論制作切片時(shí)所取材的組織材料是動(dòng)物亦或是人體的器官組織，由于各自具體組成成分及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的不同，用石蠟組織切片后的H.E染色，如皮膚，就比較難掌握脫水、透明及浸蠟的時(shí)間，難以在制作時(shí)切成連續(xù)的切片，初學(xué)者難以掌握。用整塊組織H.E染色法制作切片，則大多能獲得滿(mǎn)意的連續(xù)石蠟切片，一批次可制作一百?gòu)?，比單片片染制作法效率要高，適宜于大批量切片制作需求。

4.3 可對(duì)染色進(jìn)行彌補(bǔ) 整塊組織H.E染色制作切片時(shí)，染色不理想時(shí)，可進(jìn)行彌補(bǔ)。如染色較淺，可分別進(jìn)行蘇木精及伊紅重復(fù)染色，如果染色過(guò)深，蘇木精染色如果過(guò)深時(shí)，可在95%酒精中進(jìn)行脫色，以對(duì)蘇木精進(jìn)行脫色;伊紅染色如果過(guò)深時(shí)，可在70%酒精中進(jìn)行脫色，以對(duì)伊紅進(jìn)行脫色。染色效果直至制作者滿(mǎn)意為止。

綜上，本實(shí)驗(yàn)利用自行配制的染液進(jìn)行整塊組織H.E染色制作切片，具有許多的優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量教學(xué)切片制作需求。本方法切實(shí)可行。值得推廣應(yīng)用。

［1］黃亞鳳.石蠟切片HE染色體會(huì)［J］.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，19(4):436