王兆鉞(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇省血液研究所，衛(wèi)生部血栓與止血重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州 215006)

出血在臨床上相當(dāng)常見(jiàn)，約占血液病門(mén)診的1/3，除血液科外，臨床各科也都有出血問(wèn)題。引起出血的最主要原因?yàn)檠“辶炕蛸|(zhì)的異常和凝血障礙，先天性或獲得性血管異常、纖溶亢進(jìn)以及循環(huán)中抗凝物質(zhì)增多等因素也可導(dǎo)致出血。在有嚴(yán)重出血時(shí)，需要給予止血藥幫助止血。臨床上有效的止血藥不多，并且都有一定的局限性。維生素K只對(duì)維生素K依賴(lài)性凝血因子減少的出血有效。去氨加壓素(DDAVP，彌凝)對(duì)1型血管性血友病(vWD)有良好的治療效果，亦可作為輕、中癥血友病的首選藥物。抗纖溶藥(氨甲苯酸與氨甲環(huán)酸等)抑制纖維蛋白的水解，主要用于手術(shù)創(chuàng)傷、體外循環(huán)、肝臟疾病或腫瘤等引起的纖溶亢進(jìn)或原發(fā)性纖溶活性過(guò)強(qiáng)所引起的出血;適用于伴有纖溶亢進(jìn)的出血。重組的因子Ⅶa的適應(yīng)證為有抑制物的血友病A與血友病B與先天性因子Ⅶ缺乏，對(duì)嚴(yán)重的血小板病與嚴(yán)重肝臟疾病也有較好的效果［1］;但價(jià)格昂貴，半衰期短。其他止血藥，如卡絡(luò)磺鈉與止血敏等缺乏大規(guī)模的臨床驗(yàn)證，其確切效果難以肯定。臨床上需要有廣譜、安全可靠的止血藥。

注射用血凝酶(巴曲亭)為巴西矛頭蝮蛇(bothrops atrox)毒液中分離出來(lái)的止血成份，包括2種有效成分:巴曲酶及少量凝血因子Ⅹ激活物(FⅩA)。巴曲酶直接作用于纖維蛋白原Aα鏈Arg16-Gly17處，釋放纖維蛋白肽A后形成纖維蛋白單體Ⅰ，但不降解纖維蛋白B肽，亦不直接激活FⅩⅢ，因此不能形成穩(wěn)定的纖維蛋白。FⅩA可以直接激活FⅩ，從而激活凝血酶原，使纖維蛋白原降解成纖維蛋白，并激活FⅩⅢ，形成穩(wěn)定的纖維蛋白。注射用血凝酶已廣泛用于神經(jīng)外科、婦科與骨科手術(shù)以及消化道與呼吸道出血，臨床上有較滿意的止血效果［2，3］，我們對(duì)其體內(nèi)外止血作用進(jìn)行了較完整研究。

1 注射用血凝酶及其有效成分對(duì)凝血的影響

活化的部分凝血活酶時(shí)間(aPTT)反映了內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的活性;而凝血酶原時(shí)間(PT)反映了外源性凝血系統(tǒng)的活性。FⅩA、巴曲酶及注射用血凝酶均能縮短正常人血漿的aPTT;隨著濃度的增大，縮短aPTT的作用越明顯，其中FⅩA的作用在一定劑量范圍內(nèi)存在量效關(guān)系(r=0.889，P＜0.05)。當(dāng)FⅩA濃度為0.000 5 U·mL-1、巴曲酶及注射用血凝酶在濃度為0.05 U·mL-1時(shí)，可使正常人血漿的APTT縮短10 s左右，這表明注射用血凝酶及其有效成分可以促進(jìn)血漿的凝血過(guò)程。但FⅩA、巴曲酶及注射用血凝酶都對(duì)凝血酶原時(shí)間(PT)無(wú)明顯影響。這是由于檢測(cè)PT的試劑中含有一定量的肝素，而注射用血凝酶及其有效成份不能拮抗肝素的抗凝作用。

2 注射用血凝酶及其有效成分對(duì)出血性疾病止血異常的作用

各種凝血疾病的病理機(jī)制不同。血友病A為缺乏凝血因子Ⅷ，血友病B為缺乏凝血因子Ⅸ，維生素K依賴(lài)性凝血因子缺乏癥為凝血酶原、因子Ⅶ、Ⅸ與Ⅹ減少，vWD為 von Willebrand因子量的缺乏或質(zhì)的異常。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FⅩA濃度＞0.000 5 U·mL-1、巴曲酶及注射用血凝酶濃度＞0.05 U·mL-1時(shí)，可完全糾正血友病A患者血漿aPTT的延長(zhǎng)。因此在出血性疾病的實(shí)驗(yàn)研究中選用以上的FXA、巴曲酶與注射用血凝酶濃度。注射用血凝酶及其有效成分可完全糾正血友病A、血友病B、維生素K依賴(lài)性凝血因子缺乏癥、FⅤ缺乏癥與vWD患者血漿aPTT的延長(zhǎng)，對(duì)FⅩ缺乏癥患者aPTT的延長(zhǎng)也能明顯縮短(P＜0.001)，而對(duì)無(wú)纖維蛋白原血癥患者血漿的aPTT無(wú)明顯影響。這些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示注射用血凝酶及其有效成分能糾正除無(wú)纖維蛋白原血癥以外的凝血疾病的止血缺陷。但FⅩA、巴曲酶及注射用血凝酶不能糾正FⅤ、FⅦ、FⅩ缺乏癥、維生素K依賴(lài)性凝血因子缺乏癥患者與無(wú)纖維蛋白原血癥患者PT的延長(zhǎng)。

3 注射用血凝酶及其有效成分對(duì)FⅩ活化的影響

FⅩA可以活化純化的FⅩ或正常人血漿中的FⅩ，且隨著FⅩA濃度的增加，F(xiàn)Ⅹa的濃度也相應(yīng)升高(r=0.889，P＜0.05)，但由于仍有少量的FⅩ尚未被完全活化，F(xiàn)Ⅹa的濃度低于FⅩ的濃度。對(duì)部分出血性疾病，如血友病A、血友病B與VWD患者，F(xiàn)ⅩA可明顯使其血漿中的FⅩ活化;而FⅩ缺乏癥患者及維生素K依賴(lài)性凝血因子缺乏癥患者血漿由于缺乏FⅩ，F(xiàn)Ⅹa升高不明顯。巴曲酶不作用于FⅩ;而注射用血凝酶中僅含有少量FⅩA，尚不足以激活FⅩ。

4 注射用血凝酶及其有效成分對(duì)凝血酶生成的影響

FX是凝血酶原酶的最主要成分，活化后使凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，后者將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，導(dǎo)致了血液的凝固。FⅩA可明顯促進(jìn)正常人血漿中凝血酶的生成，但與FⅩA濃度無(wú)明顯線性相關(guān)關(guān)系。對(duì)血友病A、血友病B、vWD、FⅩ缺乏癥患者及維生素K依賴(lài)性凝血因子缺乏癥患者亦能明顯促進(jìn)其凝血酶生成(P＜0.005)。但巴曲酶及注射用血凝酶對(duì)正常人血漿及出血性疾病患者的凝血酶生成作用不明顯。巴曲酶不作用凝血酶原;而注射用血凝酶中少量的FⅩA，尚不足以激活FⅩ與凝血酶原，主要依靠巴曲酶發(fā)揮止血作用，因此低劑量的FⅩA僅具有加強(qiáng)止血的效果。

5 注射用血凝酶及其有效成分對(duì)纖維蛋白形成及纖溶系統(tǒng)的影響

注射用血凝酶與巴曲酶均可水解纖維蛋白原A肽，在0.05 U·mL-1濃度時(shí)使血漿纖維蛋白原A肽水平增加60倍;FⅩA通過(guò)激活FⅩ與凝血酶原水解纖維蛋白原A肽與B肽，在0.000 5 U·mL-1濃度時(shí)能使血漿纖維蛋白原A肽水平增加90倍。電子顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，凝血酶與FⅩA形成的纖維蛋白絲粗大緊密，而注射用血凝酶與巴曲酶形成的纖維蛋白絲纖細(xì)疏松，后者在纖維蛋白溶解實(shí)驗(yàn)中很快被溶解。這說(shuō)明注射用血凝酶由于只水解纖維蛋白原A肽，形成的止血塊很不牢固，易被水解清除［4］。這是臨床運(yùn)用注射用血凝酶止血過(guò)程中不易發(fā)生血栓的一個(gè)主要原因。

6 注射用血凝酶對(duì)肝素抗凝血作用的影響

肝素是一種主要的抗凝血藥，起著抗凝血酶的輔因子作用。臨床上在經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(PTCA)或安置支架時(shí)常規(guī)給予肝素抗凝，但有引起出血的風(fēng)險(xiǎn)。低分子量肝素(LMWH)對(duì)凝血酶的抑制作用較弱，但保留了抗活化的因子Ⅹ的作用。我們研究了FⅩA是否有拮抗肝素的作用，選用0.000 1～0.005 U·mL-1不同濃度的FⅩA，但FⅩA僅在高濃度(0.000 5 U·mL-1)時(shí)有輕度中和作用，增加FⅩA深度不影響肝素的抗活化FⅩ的活性。這是由于肝素對(duì)凝血酶與因子Ⅹa等絲氨酸蛋白酶的抑制作用只起催化作用，抑制完成后可解脫下來(lái)，再催化下一個(gè)活化的凝血因子，肝素本身不被消耗。因此不管FⅩA的濃度是多少，都不能影響肝素的催化活性。同樣，不同濃度的FⅩA對(duì)LMWH的中和作用也不明顯;改用僅含有5個(gè)糖單位的磺達(dá)肝素鈉亦顯示類(lèi)似的結(jié)果。但這些結(jié)果只說(shuō)明FⅩA不拮抗肝素的抗凝作用，注射用血凝酶中最主要成分是巴曲酶，后者仍有可能減輕手術(shù)時(shí)運(yùn)用肝素的出血風(fēng)險(xiǎn)。

7 注射用血凝酶及其有效成分對(duì)血小板聚集的影響

各種濃度的FⅩA、巴曲酶及注射用血凝酶都不引起血小板聚集，對(duì)ADP、花生四烯酸與瑞斯托霉素等多種誘導(dǎo)劑引起的血小板聚集也無(wú)影響，因此注射用血凝酶及其有效成分不能直接活化血小板。

8 注射用血凝酶對(duì)臨床出血性疾病的止血作用

在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們?cè)囉米⑸溆醚钢委熝巡與先天性因子Ⅶ缺乏癥，實(shí)驗(yàn)室檢查顯示凝血指標(biāo)輕度改善，但出血未能控制。獲得性血友病A是一嚴(yán)重出血性疾病，由于患者體內(nèi)存在抗因子Ⅷ自身抗體，輸注因子Ⅷ無(wú)效。我們?cè)囉米⑸溆醚钢委?例獲得性血友病A性疾病患者，實(shí)驗(yàn)室檢查示aPTT輕度縮短，加用凝血酶原復(fù)合物以及免疫抑制劑等綜合治療后出血最后完全停止。初步結(jié)果表明，注射用血凝酶可做為獲得性血友病A的一種輔助治療藥物。但我們發(fā)現(xiàn)給與大劑量注射用血凝酶(8 U·d-1)并延長(zhǎng)給藥時(shí)間(5 d)可能因纖維蛋白原過(guò)多降解會(huì)導(dǎo)致血漿纖維蛋白原水平的降低。

我們的研究工作證實(shí)了注射用血凝酶的止血效果，并首次觀察到注射用血凝酶可糾正多種出血性疾病的止血異常。這項(xiàng)研究表明:(1)注射用血凝酶體外局部止血有肯定的效果;(2)注射用血凝酶中的巴曲酶在止血中起了主要作用，F(xiàn)XA含量很低，只起次要作用;(3)注射用血凝酶引起的纖維蛋白凝塊易被分解，維持時(shí)間較短，因此常規(guī)劑量的注射用血凝酶無(wú)致血栓危險(xiǎn);但如連續(xù)大量給藥數(shù)天后可能使血漿纖維蛋白原降低;(4)注射用血凝酶可作為多數(shù)出血性疾病止血的輔助藥物，但不適用于無(wú)(低)纖維蛋白原血癥、DIC或纖維蛋白溶解亢進(jìn);(5)較長(zhǎng)時(shí)間使用大劑量注射用血凝酶可能導(dǎo)致血漿纖維蛋白原水平，推薦在臨床上短期應(yīng)用常規(guī)劑量。

［1］ de Paula EV，Kavakli K，Mahlangu J，et al.Recombinant factor VIIa analog(vatreptacog alfa［activated］)for treatment of joint bleeds in hemophilia patients with inhibitors:a randomized controlled trial［J］.J Thromb Haemost，2012，10(1):81.

［2］ 盧海武，林少芒，邵子力，等.巴曲亭——蛇毒凝血酶在普通外科手術(shù)中的應(yīng)用研究［J］.血栓與止血學(xué)雜志，2003，9(1):18.

［3］ 韋 帆，廖 陽(yáng).血凝酶的臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.臨床合理用藥，2009，2(19):114.

［4］ Magalhaes HP，Magalhaes A，Juliano L，et al.Mechnism of action and detem-lination of the best substrate for a thrombin-like enzyme from Lacchesis muta muta venom by regression analysis of the kinetic parameters determined with peptidyl p-nitroanilide substrates［J］.Toxicon，2006，47(4):453.