尹小花， 解文菁， 尹洪濤綜述， 孟紅梅審校

顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)是最常見(jiàn)的癲癇類型，大約占40%，且很大一部分為藥物難治性癲癇，有統(tǒng)計(jì)表明難治性癲癇中70%為T(mén)LE，故是目前研究的熱點(diǎn)。海馬硬化是TLE的特征性病理改變，包括海馬神經(jīng)元丟失和異常苔蘚纖維出芽，常常繼發(fā)于最初的顱腦損傷，包括腦外傷、腦卒中、腦腫瘤、腦膜炎和腦炎、兒童時(shí)期的熱性驚厥以及癲癇持續(xù)狀態(tài)等，也有一部分病因不明。大量研究表明TLE的形成過(guò)程實(shí)際上是海馬可塑性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建的過(guò)程，然而亦有人認(rèn)為海馬的病理改變是反復(fù)癇性發(fā)作的結(jié)果。隨著后基因時(shí)代的到來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過(guò)比較癲癇患者或動(dòng)物模型組與對(duì)照組的腦組織(大腦皮層、海馬)、體液(CSF)或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(線粒體)的差異蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了許多可能與癲癇相關(guān)的蛋白質(zhì)，這為進(jìn)一步闡明癲癇的發(fā)病機(jī)制提供了線索，為新型抗癲癇藥物的研發(fā)提供了分子靶點(diǎn)，并有利于耐藥機(jī)制的研究，目前在TLE、難治性癲癇、失神發(fā)作中已經(jīng)取得了一定成果?，F(xiàn)將蛋白質(zhì)組學(xué)在TLE海馬組織中的研究進(jìn)展綜述如下。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)概述

蛋白質(zhì)組(proteome)的概念最早是由澳大利亞學(xué)者Wilkins和 Williams［1］提出，指的是一個(gè)基因組(genome)表達(dá)的全部蛋白質(zhì)(protein)或一種細(xì)胞、組織、體液、生物體在特定時(shí)空上表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，闡明蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，以及在整體水平上研究蛋白質(zhì)組成與調(diào)控的活動(dòng)規(guī)律。蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要依賴4大技術(shù):蛋白質(zhì)分離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)、蛋白質(zhì)相互作用分析及生物信息學(xué)。

任何一種疾病在表現(xiàn)出可察覺(jué)的癥狀之前，就已經(jīng)有某些蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、表達(dá)數(shù)量、修飾方式與相互作用方面發(fā)生了變化。臨床上我們通過(guò)比較生理與病理狀態(tài)下細(xì)胞、體液或組織的差異蛋白質(zhì)，即比較蛋白質(zhì)組學(xué)，可以發(fā)現(xiàn)與各種疾病相關(guān)的特異蛋白，進(jìn)而為闡明疾病的病因與發(fā)病機(jī)制提供線索，為疾病的診斷與判斷預(yù)后提供生物學(xué)指標(biāo)，為疾病防治藥物的研發(fā)和篩選提供分子靶點(diǎn)。目前比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如退行性疾病(阿爾茨海默病、帕金森病)、脫髓鞘疾病(多發(fā)性硬化、格林-巴利綜合征)、腦血管病和癲癇等，并取得了一定進(jìn)展。

2 海馬蛋白質(zhì)組學(xué)研究概況

功能上，海馬是邊緣系統(tǒng)的一部分，與學(xué)習(xí)、記憶、情感、應(yīng)激和老化等有關(guān)，是目前多種疾病如阿爾茨海默病、精神分裂癥、抑郁癥、唐氏綜合癥和癲癇等的研究焦點(diǎn)。人類、大鼠和小鼠的海馬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)分別于2004年［2］、2005年［3］和2006年［4］建立，促進(jìn)了這些疾病的海馬蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

結(jié)構(gòu)上，海馬分為CA1～CA4和齒狀回(DG)5個(gè)亞區(qū)，各亞區(qū)的結(jié)構(gòu)、功能不同，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的易損性也不同。另外，在海馬內(nèi)存在一條三級(jí)興奮性突觸環(huán)路，即內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元經(jīng)穿通纖維投射至齒狀回顆粒細(xì)胞、進(jìn)而經(jīng)苔狀纖維投射至CA3區(qū)錐體細(xì)胞、再經(jīng)Schaffer側(cè)支投射至CA1區(qū)錐體細(xì)胞，然而海馬可能還存在其他信息處理環(huán)路。因此，對(duì)海馬各亞區(qū)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有更重要的意義。Focking等［5］比較了正常海馬各亞區(qū)的蛋白質(zhì)表達(dá)，發(fā)現(xiàn) CA2/3與CA4、DG、CA1之間分別有74、66、55 個(gè)差異蛋白，神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白在CA2/3區(qū)表達(dá)顯著上調(diào)，表明這一區(qū)域星形細(xì)胞的數(shù)量增多或體積增大。這一發(fā)現(xiàn)有助于我們理解海馬環(huán)路內(nèi)不同細(xì)胞的活動(dòng)水平，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能可能與氧化磷酸化和代謝活動(dòng)有關(guān)。

3 TLE的海馬蛋白質(zhì)組學(xué)研究

3.1 研究對(duì)象的來(lái)源 TLE的研究對(duì)象包括:(1)患者:主要是內(nèi)側(cè)顳葉(海馬)硬化的手術(shù)切除標(biāo)本，盡管有助于尋找人的癲癇相關(guān)蛋白。但缺點(diǎn)是一方面由于經(jīng)濟(jì)原因及手術(shù)創(chuàng)傷大，標(biāo)本來(lái)源受限;另一方面無(wú)法觀察差異蛋白的早期及動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。(2)動(dòng)物模型:目前主要有兩種類型的TLE模型，第一種是應(yīng)用興奮毒性物質(zhì)(海人藻酸、匹魯卡品等)誘導(dǎo)急性癲癇發(fā)作，然后發(fā)展成自發(fā)性癲癇狀態(tài);第二種是電刺激誘發(fā)慢性復(fù)發(fā)性癲癇。這些模型在癥狀學(xué)上表現(xiàn)為自發(fā)抽搐，證實(shí)海馬、杏仁核和其它邊緣結(jié)構(gòu)在癲癇發(fā)病中占有中心地位;其病理上特異的海馬損傷與TLE的海馬硬化相似;另外這些動(dòng)物模型對(duì)大部分抗癲癇藥耐受，符合TLE的臨床特點(diǎn)，因此為研究TLE提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，然而盡管如此仍無(wú)法準(zhǔn)確模擬人的病理生理狀態(tài)。

3.2 TLE發(fā)病機(jī)制、海馬病理改變與蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)性研究 TLE分為內(nèi)側(cè)顳葉癲癇和外側(cè)顳葉癲癇，其中內(nèi)側(cè)顳葉癲癇大部分屬于藥物難治性癲癇，其特征性的病理特點(diǎn)是海馬細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，即海馬硬化。這部分患者往往外科手術(shù)治療有效，手術(shù)后能夠控制大約80%～90%的癇性發(fā)作。然而海馬硬化是內(nèi)側(cè)顳葉癲癇的原因還是結(jié)果目前仍存在很大爭(zhēng)議，通過(guò)研究TLE海馬的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，有助于闡明TLE的分子發(fā)病機(jī)制和病理形成機(jī)制。

Yang等通過(guò)雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)研究?jī)?nèi)側(cè)顳葉癲癇患者海馬的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架蛋白［6］、載脂蛋白A-I［7］、細(xì)胞內(nèi)酰基輔酶A硫酯水解酶［8］和腦衰蛋白反應(yīng)介導(dǎo)蛋白-2［9］表達(dá)異常，這些蛋白改變有助于闡明內(nèi)側(cè)顳葉癲癇的分子發(fā)病機(jī)制。Jiang等［10］利用雙向凝膠電泳及基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間技術(shù)，研究耐藥性癲癇大鼠海馬的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)變化，結(jié)果鑒定出5種蛋白升高和14種蛋白降低，其中升高的電壓依賴性陰離子通道1和降低的電壓依賴性陰離子通道2可使線粒體ATP的生成減少和運(yùn)輸障礙，最終導(dǎo)致能量衰竭和細(xì)胞凋亡，這可能與難治性癲癇的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

驚厥性癲癇持續(xù)狀態(tài)與繼發(fā)的海馬損傷和內(nèi)側(cè)顳葉硬化有關(guān)。氯化鋰-匹魯卡品和海人酸誘導(dǎo)的TLE大鼠模型，經(jīng)過(guò)急性癲癇持續(xù)狀態(tài)、靜止期、慢性自發(fā)性發(fā)作期3個(gè)典型的發(fā)病過(guò)程，可用來(lái)研究海馬損傷的分子和病理形成機(jī)制。Greene等［11］分析了匹魯卡品TLE大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后早期的海馬蛋白質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白-27、二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白-2、細(xì)胞骨架蛋白和二氫蝶呤還原酶表達(dá)上調(diào)，這些蛋白可能與癲癇的病理機(jī)制、神經(jīng)保護(hù)及神經(jīng)元反應(yīng)有關(guān)，因此通過(guò)調(diào)節(jié)這些蛋白表達(dá)可以抑制海馬損傷及繼發(fā)的癲癇形成。

海馬損傷與興奮性毒性有關(guān)，有證據(jù)表明氧化應(yīng)激參與興奮性毒性損傷，然而具體的分子機(jī)制尚不清楚。Furukawa等［12］通過(guò)雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)研究海人酸癲癇大鼠海馬的氧化損傷蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白-4、纈酪肽包含蛋白、線粒體內(nèi)膜蛋白、α-互聯(lián)蛋白和絡(luò)氨酸3-單氧酶羥基化，因羥基化是蛋白質(zhì)氧化的表現(xiàn)形式，故這些蛋白受到氧化損傷，推測(cè)可能與海人酸興奮性毒性導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元死亡有關(guān)，這些蛋白點(diǎn)可作為癲癇治療的潛在靶點(diǎn)來(lái)防治癲癇相關(guān)性神經(jīng)元死亡。

內(nèi)側(cè)顳葉硬化的病理特點(diǎn)之一是海馬齒狀回反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生和顆粒細(xì)胞軸突發(fā)芽，但其具體的分子機(jī)制尚不清楚。Li等［13］利用雙向凝膠電泳和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜研究普魯卡因TLE大鼠齒狀回的蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有24個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中包括9個(gè)磷酸化蛋白。這些蛋白在細(xì)胞結(jié)構(gòu)形成及維持、突觸活動(dòng)、能量代謝、細(xì)胞應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用，推測(cè)可能與TLE海馬齒狀回的病理改變有關(guān)。

通過(guò)TLE海馬改變推測(cè)眾多基因與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與其發(fā)病機(jī)制，然而無(wú)法通過(guò)患者腦組織研究癲癇早期階段的基因變化，為了研究TLE的動(dòng)態(tài)發(fā)展的分子機(jī)制，Liu［14］等通過(guò)建立匹魯卡品TLE模型，利用雙向凝膠電泳技術(shù)研究大鼠海馬的急性期和潛伏期蛋白質(zhì)組學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)57種差異蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)根據(jù)生物學(xué)功能可以分成五大類，分別為細(xì)胞骨架蛋白、突觸相關(guān)蛋白、線粒體相關(guān)蛋白、離子通道蛋白和熱休克蛋白。國(guó)內(nèi)學(xué)者榮佳［15］、張進(jìn)［16］亦對(duì)氯化鋰-匹羅卡品TLE模型的海馬蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了研究。綜合分析這些差異蛋白，推測(cè)TLE的分子發(fā)病機(jī)制可能與細(xì)胞骨架受損、突觸可塑性改變、能量代謝異常和氧化應(yīng)激有關(guān)。

3.3 抗癲癇藥物作用機(jī)制、療效分析及靶點(diǎn)選擇的研究 Wu等［17］研究了內(nèi)側(cè)顳葉癲癇大鼠丙戊酸治療后海馬的蛋白質(zhì)組學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期應(yīng)用丙戊酸能夠防止致癇病理結(jié)構(gòu)及自發(fā)癲癇的形成，故海馬蛋白質(zhì)表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的改變與TLE的形成密切相關(guān)，這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)可作為抗癲癇治療的潛在靶點(diǎn)。Paulson等［18］研究了左乙拉西坦對(duì)大鼠海馬組織細(xì)胞增殖及蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，結(jié)果顯示左乙拉西坦并不影響海馬的細(xì)胞增殖，但能引起海馬蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，這些差異蛋白參與細(xì)胞骨架的形成及維持、能量代謝、神經(jīng)傳遞、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、髓鞘形成和應(yīng)激反應(yīng)等生理過(guò)程，推測(cè)這些蛋白可能與左乙拉西坦的抗癲癇機(jī)制有關(guān)。鉤藤是一種中藥，具有抗驚厥效應(yīng)，Lo等［19］研究了鉤藤對(duì)海人酸癲癇大鼠海馬蛋白質(zhì)組學(xué)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海人酸癲癇大鼠海馬的親環(huán)素A表達(dá)下降，鉤藤治療后表達(dá)上升，結(jié)果表明親環(huán)素A可能與鉤藤的抗驚厥效應(yīng)有關(guān)。

Greene［11］、榮佳［15］等通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)匹魯卡品TLE大鼠海馬組織中二嘧啶酶相關(guān)蛋白-2(DRP-2)表達(dá)上調(diào)。由于DRP-2能夠促進(jìn)微管組裝，在軸突的生長(zhǎng)、發(fā)育和分支以及神經(jīng)元的再生、極性的建立和維持中發(fā)揮重要作用，故推測(cè)DRP-2與顳葉癲癇形成過(guò)程中海馬異常神經(jīng)突起發(fā)芽導(dǎo)致的突觸重塑密切相關(guān)。因此調(diào)控DRP-2的表達(dá)或功能，可阻斷癲癇的發(fā)生、發(fā)展。研究表明［20］尼克酰胺對(duì)DRP-2有拮抗功能，能夠抑制培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)，制止癇性發(fā)作，并已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)作為治療部分性發(fā)作的輔助用藥。

反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生在癲癇的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［21］，而膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要成分及骨架蛋白之一，可用來(lái)特異性地標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，并被認(rèn)為是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志［22］。故深入研究GFAP表達(dá)的調(diào)控，有效控制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，可成為治療癲癇的潛在手段。Xu等［23］通過(guò)免疫組化、蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光的方法發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠海馬中磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)和GFAP表達(dá)上調(diào)，而STAT3的磷酸化抑制劑AG490能夠抑制GFAP的表達(dá)，故推測(cè)p-STAT3在癲癇的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，我們可通過(guò)調(diào)控STAT3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)抑制GPAP的表達(dá)及反應(yīng)性星形細(xì)胞膠質(zhì)化，進(jìn)而有效治療癲癇。

4 展望

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的開(kāi)發(fā)和發(fā)展有助于我們發(fā)現(xiàn)有關(guān)TLE的形成機(jī)制、病理生理過(guò)程和臨床生物標(biāo)記物，進(jìn)而有利于尋找預(yù)防、診斷及治療方法。然而TLE的形成是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，許多重要的基因、蛋白質(zhì)和信號(hào)通路組成的生物網(wǎng)絡(luò)參與其發(fā)病過(guò)程。除了差異蛋白的研究，我們需進(jìn)一步探索系統(tǒng)生物網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)的功能變化、蛋白質(zhì)間相互作用、差異基因組和功能基因組，為研發(fā)新型抗癲癇藥物及尋求行之有效的治療手段提供依據(jù)。

［1］Wasinger VC，Cordwell SJ，Cerpa-Poljak A，etal.Progress with geneproductmapping of the Mollicutes:Mycoplasma genitalium［J］.Electrophoresis，1995，16(7):1090-1094.

［2］Yang JW，Czech T，Lubec G.Proteomic profiling of human hippocampus［J］.Electrophoresis，2004，25(7 ～ 8):1169-1174.

［3］FountoulakisM，TsangarisGT，Maris A，etal.The ratbrain hippocampus proteome［J］.JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2005，819(1):115-129.

［4］Pollak DD，John J，Hoeger H，etal.An integrated map of themurine hippocampal proteome based upon fivemouse strains［J］.Electrophoresis，2006，27(13):2787-2798.

［5］Focking M，ChenWQ，Dicker P，etal.Proteomic analysisof human hippocampus shows differential protein expression in the different hippocampal subfields［J］.Proteomics，2012，12(15 ～16):2477-2481.

［6］Yang JW，Czech T，F(xiàn)elizardo M，etal.Aberrantexpression of cytoskeleton proteins in hippocampus from patients with mesial temporal lobe epilepsy［J］.Amino Acids，2006，30(4):477-493.

［7］Yang JW，Czech T，Gelpi E，etal.Extravasation of plasma proteins can confound interpretation of proteomic studies of brain:a lesson from apo A-I in mesial temporal lobe epilepsy［J］.Brain Res Mol Brain Res，2005，139(2):348-356.

［8］Yang JW，Czech T，Yamada J，etal.Aberrant cytosolic acyl-CoA thioester hydrolase in hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy［J］.Amino Acids，2004，27(3 ～4):269-275.

［9］Czech T，Yang JW，Csaszar E，etal.Reduction of hippocampal collapsin responsemediated protein-2 in patients with mesial temporal lobe epilepsy［J］.Neurochem Res，2004，29(12):2189-2196.

［10］Jiang W，Du B，Chi Z，etal.Preliminary explorations of the role of mitochondrial proteins in refractory epilepsy:some findings from comparative proteomics［J］.JNeurosci Res，2007，85(14):3160-3170.

［11］Greene ND，Bamidele A，Choy M，etal.Proteome changes associated with hippocampal MRI abnormalities in the lithium pilocarpine-induced model of convulsive status epilepticus［J］.Proteomics，2007，7(8):1336-1344.

［12］Furukawa A，Kawamoto Y，Chiba Y，etal.Proteomic identification of hippocampal proteins vulnerable to oxidative stress in excitotoxin-induced acute neuronal injury［J］.Neurobiol Dis，2011，43(3):706-714.

［13］Li A，Choi YS，Dziema H，etal.Proteomic profiling of the epileptic dentate gyrus［J］.Brain Pathol，2010，20(6):1077-1089.

［14］Liu XY，Yang JL，Chen LJ，etal.Comparative proteomics and correlated signaling network of rat hippocampus in the pilocarpinemodel of temporal lobe epilepsy［J］.Proteomics，2008，8(3):582-603.

［15］榮 佳，崔亞洲，周小艷，等.顳葉癲癇大鼠模型海馬蛋白質(zhì)組學(xué)的研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，49(2):39-43.

［16］張 進(jìn)，丁美萍，劉 照，等.顳葉癲癇大鼠海馬差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)的篩選研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2006，22(9):1779-1783.

［17］Wu L，Peng J，Wei C，etal.Characterization，using comparative proteomics，of differentially expressed proteins in the hippocampus of the mesial temporal lobe of epileptic rats following treatment with valproate［J］.Amino Acids，2011，40(1):221-238.

［18］Paulson L，Persson A，Vonck K，etal.Effect of levetiracetam on hippocampal protein expression and cell proliferation in rats［J］.Epilepsy Res，2010，90(1 ～2):110-120.

［19］Lo WY，Tsai FJ，Liu CH，etal.Uncaria rhynchophylla upregulates the expression of MIF and cyclophilin A in kainic acid-induced epilepsy rats:A proteomic analysis［J］.Am JChin Med，2010，38(4):745-759.

［20］Hensley K，Venkova K，Christov A，etal.Collapsin responsemediator protein-2:an emerging pathologic feature and therapeutic target for neurodisease indications［J］.Mol Neurobiol，2011，43(3):180-191.

［21］de Lanerolle NC，Lee TS，Spencer DD.Astrocytes and epilepsy［J］.Neurotherapeutics，2010，7(4):424-438.

［22］梁 益，孫紅斌，喻 良，等.鋰-匹羅卡品致癲大鼠海馬膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達(dá)及意義［J］.卒中與神經(jīng)雜志，2009，16(5):280-283.

［23］Xu Z，Xue T，Zhang Z，etal.Role of signal transducer and activator of transcription-3 in up-regulation of GFAPafter epilepsy［J］.Neurochem Res，2011，36(12):2208-2215.