吳彥青 高 穎 朱陵群 婁麗霞 張東梅

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700）

目前研究認(rèn)為炎性細(xì)胞向CNS的遷移和浸潤(rùn)是人類(lèi)多發(fā)性硬化（MS）發(fā)病的主要因素［1-2］。MS特征性病理改變?yōu)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)內(nèi)散在而多發(fā)的腦白質(zhì)或脊髓中的脫髓鞘病灶血管周?chē)鶷細(xì)胞、B細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)［3-4］。在MS的研究中發(fā)現(xiàn)髓鞘抗原特異性CD4+及CD8+T細(xì)胞對(duì)其臨床和病理改變具重要作用［5］。為進(jìn)一步明確實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）發(fā)病過(guò)程中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥程度的動(dòng)態(tài)變化及中藥益腎達(dá)絡(luò)飲的作用機(jī)制，本部分研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以β-actin作為對(duì)照，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CD4mRNA在EAE小鼠腦和脊髓中的表達(dá)變化，為MS在發(fā)病過(guò)程中發(fā)病程度與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性聚集提供依據(jù)和下一步可能干預(yù)的途徑。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 C57BL/6小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）：2005-0013。 選用 8～10 周齡雌性C57BL/6小鼠108只，體質(zhì)量（18.4±0.8）g。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所二級(jí)動(dòng)物中心飼養(yǎng)室。

1.2 試劑 MOG35-55多肽（MEVGWYRSPFSRVVHLYNGK）由北京賽百盛生物工程公司合成，純度（HPLC）98.3%；完全弗氏佐劑（CFA）購(gòu)自美國(guó) sigma 公司，批號(hào)：049K8700；百日咳毒素（PTX）購(gòu)自美國(guó)sigma公司，批號(hào)：P7208；結(jié)核分枝桿菌（H37RA）購(gòu)自美國(guó)DIFCO公司，批號(hào)：0172191；POWERSYBRGREENPCRMASTER試劑購(gòu)于美國(guó)ABI公司，批號(hào)：4367659。

1.3 藥物 益腎達(dá)絡(luò)飲（由熟地黃、石菖蒲、梔子、豨薟草等藥物組成）飲片購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，常規(guī)方法煎煮，收集濾液并文火煎煮濃縮制成2 g生藥/mL的水提物。醋酸潑尼松，天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)：081206，用去離子水配制成0.39 mg/mL溶液。

1.4 模型制備 采用MOG35-55抗原免疫C57BL/6小鼠：將等體積的 MOG35-55 水溶液 （每 100 μL 含 MOG35-55200 μg）與完全弗氏免疫佐劑（每100 μL含結(jié)核桿菌H37RA500 μg）混合乳化制成油包水的抗原乳劑。于免疫動(dòng)物當(dāng)日記為第0日，模型組、激素組、中藥組每只小鼠背側(cè)脊柱中線兩側(cè)分4點(diǎn)皮下注射共計(jì)0.2 mL MOG35-55抗原配劑，佐劑組每只小鼠背側(cè)脊柱中線兩側(cè)分4點(diǎn)皮下注射共計(jì)0.2 mL不含MOG35-55的油包水乳劑。注射完配劑30 min后，佐劑組、模型組、激素組、中藥組每只小鼠均腹腔內(nèi)注射0.1 mL（含400 ng PTX）百日咳毒素溶液，48 h后再次腹腔內(nèi)注射0.1 mL PTX溶液1次；正常組小鼠不給予任何藥物干預(yù)。

1.5 分組與給藥 實(shí)驗(yàn)分4個(gè)取材時(shí)點(diǎn)，即造模后7 d（發(fā)病前期）、14 d（發(fā)病初期）、24 d（發(fā)病急性期）和 40 d（慢性期）。 實(shí)驗(yàn)前將所有C57BL/6小鼠隨機(jī)分配至5個(gè)組：正常組、佐劑組、模型組、激素治療組、中藥治療組，正常組24只，佐劑組24只，模型組24只，激素組18只，中藥組18只。免疫后第7日起，每日給予各組小鼠灌服相應(yīng)的藥物。

1.6 神經(jīng)功能評(píng)分 小鼠免疫后，采用盲法由兩名觀察者進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，觀察時(shí)間為第0日到第40日（共41 d），評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)Kono等［6］的5級(jí)評(píng)分法：0分為小鼠不發(fā)??；1分為小鼠出現(xiàn)尾部張力降低或輕度步態(tài)笨拙；2分為小鼠尾部完全無(wú)張力，和（或）中度步態(tài)異常，和（或）姿態(tài)維持缺乏；3分為小鼠肢體明顯力弱；4分為小鼠肢體麻痹或癱瘓；5分為小鼠處于瀕死狀態(tài)。測(cè)評(píng)分≥1分為發(fā)病動(dòng)物。評(píng)價(jià)EAE發(fā)病嚴(yán)重程度的指標(biāo)包括：每日平均臨床評(píng)分、平均起病天數(shù)、疾病指數(shù)及平均最高評(píng)分［7］。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CD4mRNA的表達(dá) CD4及βactin引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

小鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死后，超凈工作臺(tái)上快速取大腦和脊髓組織，每組6只，液氮冷凍。取腦或脊髓組織約100 mg，采用異硫氰酸胍一步法抽提組織總RNA。所提總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確定其完整性，并經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提RNA含量和純度。取2.0 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用SYBR Green熒光染料技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。記錄其循環(huán)閾值（Ct），每個(gè)樣品中靶基因的相對(duì)mRNA表達(dá)采用相對(duì)定量公式2-△△Ct計(jì)算，其中△Ct值＝靶基因 Ct值-β-actin Ct值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較采用單因素方差分析，以（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s）

表2 各組EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05。

組 別 平均起病天數(shù)（d） 平均最高評(píng)分（分）每日平均臨床評(píng)分（分） 疾病指數(shù)模型組3.21±1.25激素治療組 2.13±0.83*14.33±1.97*12.33±1.23 13.33±1.61*3.88±0.80 90.54±30.75 3.54±1.08 67.29±25.80*中藥治療組2.00±0.77*3.50±0.81 62.14±25.46*

2 結(jié) 果

2.1 造模后EAE小鼠行為學(xué)觀察結(jié)果 見(jiàn)表2。表2示各治療組與模型組相比，各治療組的平均起病天數(shù)明顯延遲（P＜0.05），平均最高評(píng)分明顯降低（P＜0.05），疾病指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。

2.2 造模后EAE小鼠腦和脊髓內(nèi)CD4mRNA的表達(dá) 見(jiàn)表3～表4。與正常組比較，免疫后7 d，EAE小鼠腦內(nèi)CD4mRNA的表達(dá)顯著上升（P＜0.05），而脊髓內(nèi)表達(dá)未見(jiàn)顯著升高（P＞0.05）；至免疫后14 d，EAE小鼠腦和脊髓內(nèi)CD4mRNA的表達(dá)繼續(xù)顯著上升（P＜0.01）；免疫后24 d，EAE小鼠腦和脊髓內(nèi)CD4mRNA的表達(dá)繼續(xù)顯著上升（P＜0.01）；免疫后40d，EAE小鼠腦內(nèi)CD4mRNA的表達(dá)仍顯著升高（P＜0.01），而脊髓CD4mRNA內(nèi)表達(dá)未見(jiàn)顯著升高（P＞0.05）。

表 3 各組大腦組織中CD4mRNA表達(dá)比較（CD4/β-actin，±s）

表 3 各組大腦組織中CD4mRNA表達(dá)比較（CD4/β-actin，±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

1.35±0.18*5.35±0.75** 10.38±2.28**激素治療組 5.08±1.10** 6.16±2.29**△△ 2.01±0.59**△△中藥治療組 3.09±0.68**△△ 5.49±1.50**△△ 2.20±0.59**△△14 d 24 d 1.04±0.33 1.07±0.44 2.25±0.48*△△ 1.63±0.46△△模型組40 d正常組 1.00±0.26佐劑組 1.07±0.25△△組 別7 d 1.03±0.25 1.26±0.32 3.11±0.82**

表 4 各組脊髓組織中CD4mRNA表達(dá)比較（CD4/β-actin，±s）

表 4 各組脊髓組織中CD4mRNA表達(dá)比較（CD4/β-actin，±s）

14 d 24 d 1.08±0.47 1.10±0.52 0.58±0.16△△ 1.07±0.51△△△模型組40 d正常組 1.04±0.30佐劑組 1.93±0.57△△組 別7 d 1.07±0.47 3.46±1.67*2.19±1.37 2.61±0.51** 21.58±9.31**激素治療組 0.67±0.24△△ 16.21±9.64**△△ 0.36±0.20**中藥治療組 0.95±0.51△△ 14.20±9.97*△△ 0.48±0.32*0.62±0.30

經(jīng)過(guò)益腎達(dá)絡(luò)飲治療后在14、24、40 d EAE小鼠腦組織CD4mRNA的表達(dá)同樣出現(xiàn)顯著上升（P＜0.01），但是與模型組表達(dá)比較均出現(xiàn)了顯著下降（P＜0.01）。經(jīng)過(guò)益腎達(dá)絡(luò)飲治療后EAE小鼠脊髓組織CD4mRNA的表達(dá)在14 d時(shí)尚未出現(xiàn)明顯升高，而在24 d CD4mRNA的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；在40 d時(shí)CD4mRNA的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

經(jīng)過(guò)激素治療后在 14、24、40 d EAE小鼠腦組織 CD4mRNA的表達(dá)同樣出現(xiàn)顯著上升（P＜0.01），但是在24、40 d時(shí)與模型組小鼠比較均出現(xiàn)了顯著下降（P＜0.01）。經(jīng)過(guò)激素治療后EAE小鼠脊髓組織CD4mRNA的表達(dá)在14 d時(shí)尚未出現(xiàn)明顯升高，而在24 d CD4mRNA的表達(dá)明顯升高 （P＜0.05），在40 d時(shí)脊髓中CD4mRNA的表達(dá)出現(xiàn)顯著降低（P＜0.01）。

佐劑組在免疫后7 d，與正常組比較，小鼠腦內(nèi)CD4mRNA的表達(dá)未見(jiàn)明顯改變，而脊髓內(nèi)CD4mRNA的表達(dá)顯著上升（P＜0.05）。免疫后14 d，佐劑組小鼠腦內(nèi)CD4mRNA的表達(dá)顯著上升（P＜0.05），但是與模型組相比，表達(dá)顯著降低（P＜ 0.05）。免疫后24、40 d，與正常組比較，佐劑組小鼠腦和脊髓內(nèi)CD4mRNA的表達(dá)均未見(jiàn)顯著改變；與模型組相比，腦和激素內(nèi)CD4mRNA的表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型是自身免疫性疾病的一個(gè)重要的動(dòng)物模型，其免疫學(xué)特征、病理改變和臨床表現(xiàn)與多發(fā)性硬化非常相似，被認(rèn)為是研究MS發(fā)病機(jī)制和尋求新的治療方法的理想的動(dòng)物模型［8-11］。 研究表明［12-13］，人 MS 及其動(dòng)物模型EAE是一類(lèi)主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，T細(xì)胞針對(duì)髓鞘成分的反應(yīng)在MS的發(fā)病過(guò)程中起到了關(guān)鍵的作用。其主要發(fā)病機(jī)制是某種誘因作用下激活的T細(xì)胞透過(guò)血腦屏障（BBB）進(jìn)入到腦實(shí)質(zhì)結(jié)合中樞的抗原遞呈細(xì)胞（APC）抗原，通過(guò)再刺激分泌出大量的趨化因子和細(xì)胞因子，進(jìn)一步促使B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化，募集外周血T細(xì)胞、單核細(xì)胞以及B細(xì)胞等進(jìn)入到炎癥部位，從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)軸索的損害以及神經(jīng)組織的炎癥脫髓鞘反應(yīng)。

有實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明［14］，自身反應(yīng)性CD4+Th細(xì)胞是啟動(dòng)EAE病理過(guò)程的主要效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。盡管CD4+Th細(xì)胞的活化對(duì)EAE的啟動(dòng)、誘導(dǎo)非常重要，但目前普遍認(rèn)為EAE病程中的效應(yīng)細(xì)胞（即巨噬細(xì)胞譜系）包括CNS本身的小膠質(zhì)細(xì)胞以及從血液浸潤(rùn)的單核細(xì)胞，是造成組織破壞和髓鞘脫失的主要原因。因此，淋巴細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)是MS的根本原因。

本實(shí)驗(yàn)觀察了免疫后7、14、24、40 d EAE小鼠腦和脊髓內(nèi)CD4mRNA的表達(dá)，表達(dá)量均顯著高于正常值，其中尤以免疫后24 d表達(dá)量最高，這一結(jié)果與疾病的臨床神經(jīng)功能損傷程度基本一致。脊髓組織在發(fā)病前期即免疫后7 d雖有升高，但不具有顯著性差異，考慮原因可能是脊髓中BBB的破壞比腦中在時(shí)間上有所延遲；而且在40 d脊髓組織中CD4mRNA的表達(dá)沒(méi)有升高，反而出現(xiàn)了輕度下降，考慮原因可能是機(jī)體對(duì)炎性改變的自我反應(yīng)所致。中藥治療組在免疫后14、24、40 d腦內(nèi)CD4mRNA的表達(dá)均出現(xiàn)了顯著下降，在14 d降低CD4mRNA在腦內(nèi)的表達(dá)為中藥組延遲疾病發(fā)生提供了證據(jù)，而在免疫后24、40 d降低CD4mRNA在腦內(nèi)的表達(dá)為益腎達(dá)絡(luò)飲能夠降低臨床神經(jīng)功能評(píng)分提供了依據(jù)。同時(shí)，這一研究也支持了CD4+在腦內(nèi)的表達(dá)與EAE的發(fā)病有著密切聯(lián)系［15］。

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