高健翔 張偉華 劉仁慧△

（1.首都醫(yī)科大學(xué)，北京100069；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海200437）

中醫(yī)藥防治哮喘具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，特別是通過中醫(yī)藥對(duì)全身的調(diào)節(jié)作用（神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)），協(xié)同糖皮質(zhì)激素可以有效緩解副作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿女貞子有協(xié)同激素抗炎，拮抗激素導(dǎo)致的內(nèi)源性GC-GR作用受損及保護(hù)骨代謝的作用［1-3］。為進(jìn)一步探討淫羊藿、女貞子協(xié)同激素治療哮喘的作用途徑，本實(shí)驗(yàn)在前期研究已建立的哮喘大鼠模型的基礎(chǔ)上給予地塞米松干預(yù)治療2周，并同時(shí)配合服用淫羊藿、女貞子煎劑，觀察淫羊藿女貞子合激素干預(yù)治療對(duì)哮喘大鼠ET/NO的影響作用，以期為應(yīng)用平補(bǔ)陰陽中藥協(xié)同激素干預(yù)哮喘模型提供實(shí)驗(yàn)與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性SD大鼠63只，體質(zhì)量（120±10）g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK-（軍）2007-004。

1.2 儀器402A超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）、霧化箱（以有機(jī)玻璃為材料自制，規(guī)格：40×30×20 cm3）、XH6080放免儀（西安核儀廠）、電動(dòng)勻漿機(jī)（上海精密儀器儀表有限公司），721分光光度計(jì)（島津公司）。

1.3 試劑與藥物卵清白蛋白（OVA）、氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司）；ET-1放免測(cè)定盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)20120328）；NO測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20120328）；NOS試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20120322）；蛋白測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)2012.330）。淫羊藿、女貞子（購于北京同仁堂藥店）；地塞米松磷酸鈉注射液（天津藥業(yè)焦作有限公司，批號(hào)10081711）；阿斯美膠囊（上海三共制藥有限公司，批號(hào)908020）。

1.4 分組方法 按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，即正常對(duì)照組（10只），哮喘模型組（10只），激素干預(yù)組（11只），淫羊藿女貞子組（11只），淫羊藿女貞子合激素組（11只），阿斯美組（10只）。

1.5 造模與給藥參考文獻(xiàn)［4］方法 于實(shí)驗(yàn)第1～35日，除正常對(duì)照組外，其余動(dòng)物全部造模。在普通哮喘模型制備成功的基礎(chǔ)上，各造模組均每周2次給予1%OVA霧化吸入直至第48日結(jié)束。激素干預(yù)組、淫羊藿女貞子合激素組每日腹腔注射地塞米松0.5 mg/kg體質(zhì)量，連用2周。淫羊藿女貞子組、阿斯美組于實(shí)驗(yàn)第36日開始分別灌胃淫羊藿女貞子水溶液（9.5 g/kg體質(zhì)量）、阿斯美水溶液（25.11 mg/kg體質(zhì)量），每日1次，直至48 d。淫羊藿女貞子合激素組在激素干預(yù)組處理的基礎(chǔ)上，于實(shí)驗(yàn)35 d開始灌胃淫羊藿女貞子水溶液（9.5 g/kg體質(zhì)量），每日1次，灌胃至第48日。實(shí)驗(yàn)中，淫羊藿女貞子合激素組動(dòng)物死亡1只。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)大鼠腹腔麻醉，迅速開胸，取肺組織適量，在冰冷的生理鹽水中漂洗，拭干，稱重后，以預(yù)冷的生理鹽水勻漿，制成10%的組織勻漿，離心，取組織勻漿上清分裝凍存。（1）肺ET-1：按照試劑盒說明書，采用RIA法檢測(cè)ET-1含量并同時(shí)以測(cè)得勻漿上清蛋白含量（g）進(jìn)行校正。（2）肺組織NO、NOS（分型）：按照試劑盒說明書，均采用分光光度計(jì)法檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件包完成。數(shù)據(jù)采用（x±s）表示，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果 選擇LSD（方差齊）或Tamhane’sT2（方差不齊）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織ET-1、NO、ET/NO的比較見表1。與正常對(duì)照組比較，哮喘模型組ET-1、NO含量均顯著上升（P均＜0.01）；與哮喘模型組比較，激素干預(yù)組，淫羊藿女貞子組，淫羊藿女貞子合激素組和阿斯美組的ET-1含量均顯著降低（P＜0.05或0.01），僅淫羊藿女貞子合激素組NO含量顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠肺組織ET-1、NO水平比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織ET-1、NO水平比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與哮喘模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別nET-1NO（U/L）正常對(duì)照組1035.36±11.2851.86±18.63哮喘模型組1081.07±26.60**93.29±22.06**激素干預(yù)組1158.22±15.40△△75.32±23.63淫羊藿女貞子組1165.27±19.84△81.90±30.83淫羊藿女貞子合激素組1049.40±15.70△△63.49±25.91△阿斯美組1060.45±14.60△75.26±28.31

2.2 各組大鼠肺組織tNOS，iNOS，cNOS含量比較見表2。哮喘模型組較正常對(duì)照組tNOS、iNOS含量顯著上升（P＜0.05或0.01）；cNOS含量顯著降低（P＜0.01）。與哮喘模型組比較，激素干預(yù)組、淫羊藿女貞子組、淫羊藿女貞子合激素組的iNOS含量顯著降低（P均＜0.01）；淫羊藿女貞子合激素組、淫羊藿女貞子組cNOS含量顯著上升（P均＜0.05）。

表2 各組大鼠肺組織tNOS，iNOS，cNOS含量比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織tNOS，iNOS，cNOS含量比較（±s）

組別ncNOS正常對(duì)照組1010.18±3.19哮喘模型組104.93±1.87**激素干預(yù)組116.13±1.76 tNOSiNOS 17.27±5.7017.27±5.70 33.25±7.13*28.32±7.36**25.72±5.0519.59±4.77△△淫羊藿女貞子組117.76±2.71△29.08±6.5121.33±5.77△△淫羊藿女貞子合激素組1028.09±5.5220.75±5.76△△7.34±2.44△阿斯美組1029.61±6.4623.11±5.306.50±2.42

2.3 各組大鼠肺組織ET/NO（NOS）的比較見表3。各組之間ET/NO比值均無明顯差異。哮喘模型組較正常對(duì)照組ET/iNOS、ET/cNOS比值均顯著升高（P＜0.05或0.01）；與哮喘模型組比較，激素干預(yù)組、淫羊藿女貞子組、淫羊藿女貞子合激素組、阿斯美組的ET/cNOS值均顯著降低（P＜0.01）。

表3 各組大鼠肺組織ET/NO（NOS）比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織ET/NO（NOS）比較（±s）

組別nET/cNOS正常對(duì)照組103.76±1.84哮喘模型組1020.08±13.68**激素干預(yù)組119.90±2.81△△ET/NOET/iNOS 0.70±0.122.12±0.61 0.90±0.312.99±1.03*0.84±0.323.12±1.02淫羊藿女貞子組119.10±3.81△△0.90±0.363.11±0.72淫羊藿女貞子合激素組100.86±0.312.39±0.458.32±6.86△△阿斯美組100.89±0.352.69±0.7410.64±5.27△△

3 討論

ET是目前所知最強(qiáng)的支氣管收縮劑，作用緩慢而持久，有研究指出ET對(duì)去上皮的呼吸道收縮作用較上皮完整的呼吸道更強(qiáng)。因此，當(dāng)呼吸道上皮損傷時(shí)，其使呼吸道收縮的作用更明顯。目前認(rèn)為ET的作用機(jī)制有：刺激呼吸道肥大細(xì)胞釋放組胺，促進(jìn)炎癥的釋放，從而引起瀑布樣炎癥反應(yīng)，并間接使呼吸道收縮；除具有強(qiáng)烈的收縮人體大血管如肺動(dòng)脈等作用外，對(duì)支氣管微血管也有直接的收縮作用，使呼吸道黏膜血流和微循環(huán)通透性增加，導(dǎo)致呼吸道黏膜充血水腫；促進(jìn)EOS的浸潤；促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖和黏膜下腺體分泌［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果 證實(shí)模型大鼠肺組織中ET含量顯著升高，提示哮喘模型存在的支氣管收縮反應(yīng)與ET升高有密切關(guān)系。各給藥組均能明顯降低肺組織ET水平，其中以淫羊藿女貞子合激素組作用趨勢(shì)較佳。提示藥物可以通過阻止ET的生成和釋放，或抑制其作用，減輕氣道炎癥及氣道重建，降低氣道高反應(yīng)性（AHR），達(dá)到控制和預(yù)防哮喘的目的 。

大量研究表明NO及NOS在哮喘的發(fā)病中起到了重要的作用［6］。眾多研究表明，哮喘的發(fā)生是包括NO在內(nèi)的眾內(nèi)源性炎性介質(zhì)共同作用的結(jié)果 。而內(nèi)源性NO由NOS催化其底物L(fēng)-精氨酸和氧分子而生成，而合成NO的酶有3種亞型，即內(nèi)皮型（eNOS）、神經(jīng)型（nNOS）和誘導(dǎo)型（iNOS），前兩者總稱為構(gòu)成型一氧化氮合酶（cNOS）。在生理狀態(tài)下，cNOS發(fā)揮作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生低濃度的NO而發(fā)生生理效應(yīng)，如松弛血管及氣道平滑肌，神經(jīng)信號(hào)傳遞及宿主防御功能等，從而在氣道平滑肌張力調(diào)節(jié)和肺部免疫防御等方面發(fā)揮重要作用；但在病理狀態(tài)下，NO生成減少，NANC（非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)）功能發(fā)揮不足，此時(shí)iNOS被激活，由其介導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO，而局部大量NO可引起氣道充血、血漿滲漏，造成肺上皮細(xì)胞及組織損傷而誘發(fā)氣道高反應(yīng)性，同時(shí)局部NO含量的迅速增加可擴(kuò)張支氣管黏膜血管，導(dǎo)致黏膜水腫，通過非肌性機(jī)制加重氣道阻塞［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠肺組織NO、tNOS、iNOS含量均顯著上升，而cNOS含量則顯著下降，提示在哮喘發(fā)作時(shí)，因cNOS抑制而導(dǎo)致其誘導(dǎo)的發(fā)揮生理性舒張支氣管平滑肌作用的NO生成減少，氣道非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)功能發(fā)揮不足，而iNOS活性大大增強(qiáng)導(dǎo)致局部大量NO產(chǎn)生，加重氣道組織損害而誘發(fā)氣道高反應(yīng)性，與上述研究相符。與哮喘模型組相比，各給藥組中僅淫羊藿女貞子合激素組NO含量顯著降低；激素干預(yù)組、淫羊藿女貞子組、淫羊藿女貞子合激素干預(yù)組iNOS含量均顯著降低；而淫羊藿女貞子組、淫羊藿女貞子合激素組cNOS含量顯著升高。提示糖皮質(zhì)激素抗炎作用與抑制iNOS的產(chǎn)生有關(guān)。有研究表明，地塞米松可使肺組織iNOS mRNA表達(dá)量明顯減少，且具有劑量相關(guān)性，提示糖皮質(zhì)激素可在轉(zhuǎn)錄水平上抑制iNOS的活性，從而減少NO的生成［7］。而激素應(yīng)用的同時(shí)合用中藥，不僅可通過下調(diào)iNOS水平，抑制iNOS的致炎作用，減少內(nèi)源性NO生成，減輕氣道炎癥及氣道重建，降低AHR；并通過上調(diào)cNOS活性，從而誘導(dǎo)神經(jīng)源性NO而發(fā)揮對(duì)氣道的舒張作用。

生理狀態(tài)下ET/NO平衡維持氣道基礎(chǔ)張力的作用在哮喘發(fā)病過程中處于失衡狀態(tài)。由于哮喘發(fā)病中iNOS活性明顯增強(qiáng)，誘導(dǎo)大量NO生成，使ET/NO比值無法正確反映ET/NO失衡對(duì)AHR的影響［4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果 亦證實(shí)各給藥組對(duì)肺組織ET/NO比值均無明顯影響。通過相關(guān)分析進(jìn)一步證實(shí)：NO與iNOS水平呈高度正相關(guān)，而NO與cNOS水平不相關(guān)。因cNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO為氣道內(nèi)舒張性神經(jīng)遞質(zhì)，故本實(shí)驗(yàn)選擇ET/cNOS比值以觀察ET/NO失衡的影響作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 顯示，模型ET/cNOS比值明顯增高。而各給藥組均對(duì)ET/cNOS比值均有明顯降低作用，以淫羊藿女貞子合激素組作用趨勢(shì)較佳，提示激素合用中藥后可調(diào)節(jié)氣道局部生ET/NO平衡維持氣道基礎(chǔ)張力的作用，從而降低氣道高反應(yīng)性。

［1］ 劉仁慧，袁穎，張偉華，等.淫羊藿女貞子對(duì)激素干預(yù)哮喘大鼠模型撤停后階段的影響研究［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，7（7）：563-565.

［2］ 劉仁慧，許利平，王秀娟，等.淫羊藿女貞子合用地塞米松抗哮喘大鼠的研究［J］.中國中藥雜志，2012，37（10）：1497-1499.

［3］ 劉仁慧，王秀娟，袁穎，等.淫羊藿女貞子對(duì)激素干預(yù)哮喘大鼠骨代謝的影響研究［J］.吉林中醫(yī)藥，2012，32（5）：490-492.

［4］ 劉仁慧，鄭君芳，袁穎，等.淫羊藿女貞子配伍調(diào)節(jié)哮喘大鼠NO/ET及HPA軸作用的研究［J］.中國中藥雜志，2010，35（12）：1590-1593.

［5］ Avenier C，Ilenoosh C，Asheyn O，et al.Kinds of endothelin and its effect on bronchial contraction［J］.Br J Pharmcol，1990，100（5）：168-172.

［6］ 楊敏，陳平.一氧化氮在支氣管哮喘中的作用［J］.醫(yī)學(xué)與哲學(xué)，2007，28（9）：64-65.

［7］ 劉芳，張新日，張巖.糖皮質(zhì)激素對(duì)機(jī)械通氣大鼠肺組織iNOS、NO表達(dá)的影響［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，20（1）：12-15.