李淑蓮 蔡 靜 張舒曼 劉廣超 馬遠(yuǎn)方

(河南大學(xué)細(xì)胞與分子免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室河南大學(xué)免疫學(xué)研究所，開封475004)

腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor necrosisfactorrelated apoptosisinducing ligand，TRAIL)為TNF家族的成員之一，TRAIL有5種受體，4種膜結(jié)合受體(TRAIL-R1/DR4、TRAIL-R2/DR5、TRAIL-R3/DcR1、TRAIL-R4/DcR2)和 1 種可溶性受體 OPG［1］，其中 TRAIL-R1/DR4 和 TRAIL-R2/DR5胞內(nèi)段含有“死亡結(jié)構(gòu)域(Death domain，DD)”［2，3］。TRAIL 與 DR4/DR5 結(jié)合后，能夠激活死亡受體通路及線粒體通路誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡［4-6］，在臨床試驗(yàn)中也顯示出較好的抗腫瘤活性，但是肝細(xì)胞損害及一些腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的抵抗等原因，一定程度上阻礙了 TRAIL的應(yīng)用［7，8］。

近年研究發(fā)現(xiàn)，一些抗DR4/DR5的激活型抗體能夠模擬TRAIL的作用，有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且無 TRAIL 的肝細(xì)胞毒性［9，10］。本實(shí)驗(yàn)室成功研制一株抗人DR5激活型抗體-mDRA-6，前期實(shí)驗(yàn)表明，mDRA-6與細(xì)胞膜DR5結(jié)合，能夠有效激活caspase-8等死亡受體途徑信號(hào)分子，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡［11］，但mDRA-6誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中，是否有線粒體通路信號(hào)分子的激活尚不清楚，為了更全面研究mDRA-6誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在白血病細(xì)胞系Jurkat和U937細(xì)胞上，探討mDRA-6對(duì)腫瘤細(xì)胞線粒體通路信號(hào)分子的激活改變，為其臨床抗腫瘤應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 鼠抗人DR5單克隆抗體mDRA-6由本實(shí)驗(yàn)室制備;Jurkat細(xì)胞株由美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院陳有海教授饋贈(zèng)，U937細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所;RPMI Medium 1640購于Gibco公司;胎牛血清購于天津TBD公司;四氮唑藍(lán)(MTT)、DMSO購自Sigma公司;FITC-AnnexinV/PI試劑盒購自BD公司;Western細(xì)胞裂解液購自Beyotime公司;caspase-9抑制劑 Z-LEHD-FMK及caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK購于RD公司;山羊抗人 caspase-9抗體、兔抗人 caspase-3抗體購自R＆D公司;兔抗人Bcl-xl抗體購自Cell Signaling公司;兔抗人Bcl-2抗體、鼠抗人Bax、actin抗體購自Beyotime公司;山羊抗人Cytc單克隆抗體購自Santacruz公司;辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗鼠-HRP、羊抗兔-HRP及兔抗山羊IgG(H+L)購自北京中杉金橋公司;ECL顯影試劑盒購自Amershem Pharmacia公司。PVDF膜購自Milipore公司;流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)為BD公司產(chǎn)品;垂直電泳儀及電轉(zhuǎn)裝置為Thermo EC公司產(chǎn)品;凝膠圖像分析儀(Alphalmager2200)為Alpha Inntech公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1mDRA-6對(duì)Jurkat及U937細(xì)胞生長增殖抑制作用 分別收集對(duì)數(shù)生長期的Jurkat和U937細(xì)胞，加入96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為3×104/孔，分別以不同濃度 (10、5、2.5、1.25、0.64、0.32、0.16 mg/L)的mDRA-6培養(yǎng)細(xì)胞10小時(shí)，或用終濃度為10 mg/L 的 mDRA-6 分別處理細(xì)胞 1、2、4、6、8、10小時(shí)。更換新培養(yǎng)液，加入MTT(5 mg/L)20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。離心，吸棄上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩混勻，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測OD570值。每一實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按以下公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，細(xì)胞生長抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值) ×100%。

1.2.2DNA ladder檢測mDRA-6對(duì)細(xì)胞的凋亡作用 調(diào)整Jurkat及U937細(xì)胞濃度為1×107/瓶，加入終濃度為10 mg/L的 mDRA-6，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時(shí)，陰性對(duì)照為相同濃度的小鼠IgG1。收集細(xì)胞，800 r/min離心5分鐘，棄上清，PBS洗細(xì)胞2次。提取細(xì)胞DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外下觀察并拍照。

1.2.3Western blot檢測凋亡信號(hào)分子變化 取對(duì)數(shù)生長期的Jurkat及U937細(xì)胞，加終濃度為10 mg/L的mDRA-6，分別培養(yǎng)0分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)后收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，加細(xì)胞裂解液(20 mmol/L HEPES pH7.5，0.35 mmol/L NaCl，20%甘油，1%NP-40，1 mmol/L MgCl2·6H2O，0.5 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L EGTA，1 mmol/L PMSF)冰上裂解30分鐘，10 000 r/min離心15分鐘，收集上清，用BCA法檢測上清液蛋白濃度，取細(xì)胞總蛋白60 μg，進(jìn)行SDSPAGE電泳，并轉(zhuǎn)移PVDF膜。用含有5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉PVDF膜1小時(shí)，洗滌4次，分別加入抗人 caspase-9、caspase-3、bax、bcl-2、bcl-xl及Cyt c抗體，室溫孵育2小時(shí)，洗滌4次。將膜封閉于HRP標(biāo)記的二抗稀釋液中，室溫孵育1小時(shí)，TBST洗膜后，ECL反應(yīng)液中反應(yīng)1分鐘，暗室顯影。

1.2.4Caspase-9、3抑制劑對(duì)mDRA-6抑制細(xì)胞生長增殖的影響 收集Jurkat和U937細(xì)胞，接種于96孔板中，細(xì)胞密度為3×104細(xì)胞/孔，分別加入終濃度為15 μmol/L的caspase-9、3抑制劑，對(duì)照組加入同體積的 RPMI1640完全培養(yǎng)液。置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1小時(shí)后，加入終濃度為10 mg/L的 mDRA-6，終體積為 200 μl/孔，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育8小時(shí)。每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。上述MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率。

1.2.5Caspase-9抑制劑對(duì)mDRA-6誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響 分別制備Jurkat和U937細(xì)胞懸液，加入24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞數(shù)為3×105/孔，分別加入終濃度為15 μmol/L的 caspase-9抑制劑，終體積為1 ml/孔，對(duì)照組加入同體積的RPMI1640完全培養(yǎng)液。37℃孵育1小時(shí)后，加入終濃度為10 mg/L的mDRA-6，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育細(xì)胞2小時(shí)。收集細(xì)胞，用結(jié)合液洗細(xì)胞2次，并將細(xì)胞懸浮于100 μl標(biāo)記液中，加 FITC-AnnexinV/PI染液各5 μl，混勻后避光冰浴15分鐘，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。Cellquest軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1mDRA-6對(duì)Jurkat及U937細(xì)胞生長增殖影響

不同劑量(10、5、2.5、1.25、0.64、0.32、0.16 mg/L)的mDRA-6孵育Jurkat及U937細(xì)胞10小時(shí)，兩種細(xì)胞均呈現(xiàn)濃度依賴性地生長抑制;10 mg/L的mDRA-6也呈時(shí)間依賴性地抑制Jurkat及 U937細(xì)胞的生長增殖，10 mg/L的 mDRA-6孵育 Jurkat細(xì)胞6、8和10小時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)59.38%、72.56%和76.28%;10 mg/L的mDRA-6孵育U937細(xì)胞6、8和10小時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)38.67%、47.54%和50.59%，見圖1。

2.2DNA ladder檢測mDRA-6對(duì)Jurkat及U937細(xì)胞的凋亡作用 10 mg/L的mDRA-6作用Jurkat及U937細(xì)胞2小時(shí)，提取細(xì)胞DNA，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，mDRA-6處理的 Jurkat及U937細(xì)胞均呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞所特有的DNA ladder條帶，而對(duì)照組細(xì)胞無梯形圖譜產(chǎn)生，結(jié)果見圖2。

圖1 mDRA-6對(duì)Jurkat和U937細(xì)胞的生長抑制作用Fig．1 Inhibition of mDRA-6 on Jurkat and U937 cells

2.3Western blot檢測細(xì)胞凋亡分子 mDRA-6作用后，Jurkat和U937細(xì)胞內(nèi)的凋亡分子發(fā)生變化。隨著mDRA-6作用時(shí)間延長，Jurkat和U937細(xì)胞內(nèi)的促凋亡分子bax激活增多，Cyt c釋放增多，而同時(shí)細(xì)胞抗凋亡分子bcl-2及bcl-xl隨mDRA-6作用時(shí)間延長不斷減少。mDRA-6作用后，Jurkat和U937細(xì)胞內(nèi)34 kD的caspase-9裂解片段明顯增多;Jurkat和U937細(xì)胞caspase-3也顯示明顯的激活表現(xiàn)，Jurkat細(xì)胞 caspase-3激活尤為顯著，10 mg/L的mDRA-6作用Jurkat細(xì)胞5分鐘，Jurkat細(xì)胞caspase-3即有17 kD的裂解條帶顯示，且隨著mDRA-6作用時(shí)間延長，12 kD的裂解片段明顯呈現(xiàn)。結(jié)果見圖3。

圖2 DNA梯形條帶分析Fig．2 DNA ladder analysis

圖3 mDRA-6激活Jurkat及U937細(xì)胞凋亡分子Fig．3 Appototic molecule activation in Jurkat and U937 cells treated with mDRA-6

2.4Caspases-9、3抑制劑對(duì)mDRA-6抑制細(xì)胞生長增殖的影響 Caspase-9、3抑制劑能夠不同程度降低mDRA-6對(duì)Jurkat和U937細(xì)胞的生長抑制作用。預(yù)先使用caspase-9、3抑制劑孵育細(xì)胞1小時(shí)，mDRA-6所致Jurkat細(xì)胞生長抑制率分別降低了24.36%(t=5.44，P＜0.01)和31.18%(t=7.97，P＜0.01);mDRA-6所致U937細(xì)胞生長抑制率分別降低了20.82%(t=4.29，P＜0.01)和50.20%(t=12.98，P＜0.01)。Caspase-9、3抑制劑單獨(dú)使用，對(duì)Jurkat和U937細(xì)胞生長增殖無明顯影響，結(jié)果見圖4。

圖4 Caspases抑制劑對(duì)mDRA-6抑制Jurkat及U937細(xì)胞生長的影響Fig．4 The effects of caspases inhibitors on cell inhibition ratio of Jurkat and U937 traeted with mDRA-6

2.5Caspase-9抑制劑對(duì)mDRA-6誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響 AnnexinⅤ/PI雙染，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，10 mg/L的mDRA-6作用Jurkat和U937細(xì)胞2小時(shí)，細(xì)胞凋亡率分別為66.64%和38.50%。預(yù)先用15 μmol/L的 caspase-9抑制劑孵育 Jurkat或U937細(xì)胞1小時(shí)，mDRA-6誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率分別降低了32.89%和23.97%。15 μmol/L的caspase-9抑制劑對(duì)Jurkat和U937細(xì)胞無明顯凋亡作用，結(jié)果見圖5。

3 討論

TRAIL與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體(TRAIL-R1/DR4，TRAIL-R2/DR5)結(jié)合，啟動(dòng)胞外凋亡通路(死亡受體通路)和胞內(nèi)凋亡通路(線粒體通路)，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。TRAIL與含有死亡結(jié)構(gòu)域(Death domain，DD)的細(xì)胞膜DR4或DR5結(jié)合，通過銜接蛋白 FADD(Fas associated death domain，F(xiàn)ADD)，激活caspase-8/caspase-10，啟動(dòng)外源性凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［4，5］。

TRAIL胞內(nèi)凋亡通路是線粒體依賴性的凋亡通路，受Bcl-2蛋白家族中促凋亡因子和抗凋亡因子相互調(diào)控，二者的平衡對(duì)于調(diào)節(jié)線粒體功能有重要價(jià)值。胞內(nèi)凋亡通路主要的促凋亡成員Bax和Bak通過破壞線粒體膜的完整性發(fā)揮作用，bax是bcl-2家族的重要的促凋亡蛋白，在正常細(xì)胞中主要分布在胞質(zhì)，在TRAIL等多種凋亡刺激因子的作用下，可以發(fā)生轉(zhuǎn)位與線粒體相互作用，損傷線粒體造成線粒體膜電位變化，導(dǎo)致線粒體內(nèi)某些促凋亡分子，如Cyt c等外流，進(jìn)而活化caspase-9，激活效應(yīng)caspases分子，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程?？沟蛲龀蓡Tbcl-2和bcl-xl在線粒體外膜發(fā)揮作用，bcl-2和bcl-xl可以和bax等結(jié)合形成異構(gòu)二聚體，阻止bax對(duì)線粒體的損傷，以維持線粒體膜的完整性，抑制細(xì)胞凋亡。bax表達(dá)水平增加可拮抗bcl-2的作用，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［12］。

圖5 Caspases-9抑制劑抑制mDRA-6誘導(dǎo)的Jurkat/U937細(xì)胞凋亡Fig．5 Caspases-9 inhibitor inhibit the apoptosis of Jurkat and U937 cells treated with mDRA-6

研究表明激活型抗DR5抗體能夠通過死亡受體通路，激活 caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡［13，14］。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，激活型抗 DR5 抗體mDRA-6呈濃度、時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)Jurkat和U937細(xì)胞凋亡，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)線粒體通路主要凋亡分子bax表達(dá)隨mDRA-6作用時(shí)間而增多，而主要抗凋亡分子bcl-2及bcl-xl隨mDRA-6作用時(shí)間而減少，提示線粒體通路可能參與了mDRA-6誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，為了進(jìn)一步明確線粒體通路的激活，我們應(yīng)用Western blot方法，檢測線粒體釋放的凋亡因子Cyt c變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mDRA-6作用Jurkat細(xì)胞15分鐘，即可檢測到Cyt c釋放，并隨mDRA-6作用時(shí)間延長而增多;mDRA-6作用U937細(xì)胞也顯示有Cyt c釋放增多。線粒體釋放的Cyt c等凋亡因子，能夠使細(xì)胞procaspase-9自身催化形成有活性的caspase-9，隨后激活下游caspase-3等效應(yīng)caspases分子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。caspase-9激活是線粒體通路激活的重要環(huán)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)中 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，mDRA-6作用Jurkat及U937細(xì)胞后，細(xì)胞caspase-9、caspase-3均有激活片段產(chǎn)生，且預(yù)先應(yīng)用caspase-9抑制劑能夠有效抑制mDRA-6所致的Jurkat及U937細(xì)胞凋亡率，進(jìn)一步表明線粒體通路激活是mDRA-6誘導(dǎo)Jurkat及U937細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。

抗人DR5的激活型單克隆抗體具有TRAIL的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，又克服了TRAIL的受體多樣性及肝細(xì)胞毒性作用，可能較TRAIL有更好的抗腫瘤應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)中的抗DR5單克隆抗體mDRA-6，能夠有效誘導(dǎo)白血病Jurka及U937細(xì)胞凋亡，細(xì)胞線粒體通路激活是其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。對(duì)mDRA-6誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的進(jìn)一步研究，可能對(duì)提高mDRA-6抗腫瘤臨床應(yīng)用提供有用的理論基礎(chǔ)。

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