李 莉 司松波 (河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng)453007)

槲皮素(Quercetin，Que)化學(xué)名為 3，3＇，4＇，5，7-五羥基黃酮，廣泛存在于蔬菜、水果中，是中藥水紅花子中重要的黃酮類化合物，具有抗炎、降血脂等作用，近年來對其的研究多集中在抗氧化和抗興奮毒性的作用方面［1-3］。我們的前期研究結(jié)果證實(shí)水紅花子可以顯著降低流產(chǎn)率，有一定的保胎作用(結(jié)果待發(fā)表)，這些結(jié)果提示我們，其在母胎界面局部免疫微環(huán)境中可能起到有利于妊娠的建立和維持的作用。因此本研究選擇槲皮素這一單一活性成分代替水紅花子整藥作用于小鼠，確定其對小鼠動(dòng)情周期及免疫效應(yīng)的影響，并探討其對生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫功能的作用機(jī)制，為其作為中藥免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)藥物與主要試劑 槲皮素(Sigma公司)，取10 mg槲皮素，先用少量無水乙醇溶解，再加4 ml PBS稀釋，室溫放置備用。RPMI1640培養(yǎng)液(美國 Gibco 公司)，MTT［3-(4，5)-雙甲基-2-噻唑-(2，5)-二甲基溴化四氫唑鹽］(Sigma公司)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma公司)，脂多糖(LPS，寶信生物科技有限公司)，豚鼠血清(鼎國生物技術(shù)有限公司)，綿羊紅細(xì)胞(SRBC)由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理及分組 昆明種小鼠，6周齡，平均體重(25±2)g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±2)℃，濕度50% ～75%，標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料喂養(yǎng)。選擇一定數(shù)量的雌性未經(jīng)產(chǎn)小鼠，先于每天上午8∶00檢查其所處的動(dòng)情周期，連續(xù)2天，選擇在第2天開始進(jìn)入動(dòng)情間期即恰好處于動(dòng)情間期第1天的小鼠12只進(jìn)行動(dòng)情周期檢測試驗(yàn)，將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組6只，并于每天上午8∶00～9∶00鑒別其所處的動(dòng)情周期。進(jìn)行免疫功能檢測試驗(yàn)的小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組18只，雌雄各半。小鼠于每天上午9∶00以灌胃(i.g)方式給藥，連續(xù)7天，其中所有實(shí)驗(yàn)組小鼠槲皮素給藥量為1.25 mg/(天·只)，即灌服濃度為2.5 mg/ml的槲皮素藥液0.5 ml/(天·只)，所有對照組小鼠灌服PBS溶液0.5 ml/(天·只)。

1.2方法

1.2.1小鼠動(dòng)情周期的鑒定 用蘸有少許生理鹽水的無菌小棉簽在陰道側(cè)壁上1/3處輕輕刮取分泌物少許，薄而均勻地涂于玻片上，用95%的乙醇固定，經(jīng)瑞氏染液染色后，于顯微鏡下觀察小鼠陰道涂片中三種細(xì)胞，即：無核角化細(xì)胞、上皮細(xì)胞、白細(xì)胞的存在情況，依陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查法判斷其所處的動(dòng)情周期［4］。從小鼠處于動(dòng)情間期第1天開始至下一個(gè)動(dòng)情間期出現(xiàn)結(jié)束，記錄一個(gè)完整動(dòng)情周期各階段天數(shù)。

1.2.2淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力的測定 對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠均于灌胃第7天頸椎脫臼處死，無菌取脾臟，制成脾細(xì)胞懸液，分成3組，第1組加入含ConA的RPMI1640培養(yǎng)液，第2組加入含LPS的RPMI1640培養(yǎng)液，第3組加入不含ConA和LPS的RPMI1640培養(yǎng)液作為陰性對照，調(diào)細(xì)胞濃度為(1×106)個(gè)/ml，并使ConA和LPS的終濃度為5 g/ml。將樣品添加在96孔培養(yǎng)板上，每孔0.1 ml，一式三復(fù)孔，將培養(yǎng)板放入含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，每孔加入5 mg/ml的 MTT 10 μl，培養(yǎng)結(jié)束后，3 000 r/min 離心20分鐘，棄上清液，每孔加入10%的DMSO 100 μl，震蕩15分鐘。用酶標(biāo)儀在420 nm處測OD值，通過以下公式計(jì)算轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率=(實(shí)驗(yàn)組平均吸光值-陰性對照組平均吸光值)/陰性對照組平均吸光值×100%。

1.2.3淋巴細(xì)胞α-醋酸萘酯酶的檢驗(yàn) 對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠均于灌胃第7天剪尾，取小鼠新鮮血液1滴，制作血涂片后進(jìn)行淋巴細(xì)胞α-醋酸萘酯酶的檢驗(yàn)［5］。在油鏡下觀察，每只小鼠計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，求出α-醋酸萘酯酶陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.2.4巨噬細(xì)胞吞噬活性測定 對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠于末次灌胃1小時(shí)后稱量體重，按碳廓清試驗(yàn)方法［5］由小鼠尾靜脈注射墨汁，分別于注射墨汁2分鐘和10分鐘后從眼眶后靜脈叢取血20 μl，加入事先盛有2 ml 0.1%Na2CO3溶液的試管中，搖勻。用752型分光光度計(jì)以2 ml 0.1%的Na2CO3溶液作為對照在600 nm處測其光密度值。頸椎脫臼法處死小鼠，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干其表面血液后稱重。按以下公式計(jì)算未矯正的吞噬指數(shù)k和矯正吞噬指數(shù)α，α反映了每單位組織重量的吞噬活性。k=log(OD1/OD2)/(t2-t1)，α=體重/(肝重+脾重)×k1/3。

1.2.5定量溶血分光光度測定 在灌胃開始后的第2天分別給對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射0.2 ml 20%的SRBC懸液;在灌胃開始后的第7天，將小鼠摘除眼球放血，頸椎脫臼法處死，消毒腹壁，摘取脾臟，在盛有少許4℃的PBS培養(yǎng)皿內(nèi)刮脾臟，制成細(xì)胞懸液，并用200目濾網(wǎng)過濾到離心管中，2 000 r/min離心5分鐘，沉淀用1 ml 4℃的PBS懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度為(1×106)個(gè)/ml。取脾細(xì)胞懸液進(jìn)行定量溶血分光光度測定［6］，對比結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，兩組間數(shù)據(jù)采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析，以P＜0.01為差異有極顯著性。

圖1 小鼠動(dòng)情周期各時(shí)期陰道涂片F(xiàn)ig．1 Mouse vaginal smears in each of the estrous stagesNote：A.Proestrus;B.Estrus;C.Metestrus;D.Diestrus.

2 結(jié)果

2.1 對小鼠動(dòng)情周期的調(diào)節(jié)作用 陰道脫落細(xì)胞主要有三種：白細(xì)胞、上皮細(xì)胞和角化細(xì)胞。白細(xì)胞為有核的球形細(xì)胞，涂片中多見為白細(xì)胞中數(shù)量最多的中性粒細(xì)胞，常聚集成堆，核呈深染的彎曲桿狀或分葉狀。上皮細(xì)胞的細(xì)胞核大小與白細(xì)胞相似，但核呈圓形，細(xì)胞多均勻散在分布，很少聚集。角化細(xì)胞一般呈多邊形或多角形，其胞核固縮，有時(shí)甚至消化，剩下“細(xì)胞空殼”。如圖1所示，在動(dòng)情前期，涂片上全部為上皮細(xì)胞，偶有少量角化細(xì)胞;動(dòng)情期涂片全為角化細(xì)胞，偶有少量上皮細(xì)胞;動(dòng)情后期涂片上三種細(xì)胞同時(shí)存在;動(dòng)情間期涂片中角化細(xì)胞不斷減少，白細(xì)胞增多，以白細(xì)胞為主。通過觀察小鼠的陰道涂片，統(tǒng)計(jì)出各組小鼠動(dòng)情期和動(dòng)情間期天數(shù)，由表1可見，實(shí)驗(yàn)組小鼠動(dòng)情期和動(dòng)情后期天數(shù)明顯增加，和對照組相比其差異達(dá)到極顯著水平，說明槲皮素延長了小鼠的動(dòng)情期。x ± s，n=6)Tab．1 Effect of Que on the estrous cycle in mice(x ± s，n=6)

表1 槲皮素對小鼠動(dòng)情周期的影響(

表2 槲皮素對小鼠免疫功能的影響(x ± s，n=6)Tab．2 Effect of Que on the immune function in mice(x ± s，n=6)

2.2對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用

2.2.1T、B淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力的調(diào)節(jié) 由表2可見實(shí)驗(yàn)組小鼠T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與對照組相比均明顯升高(P＜0.01)，說明槲皮素可以顯著升高小鼠由ConA刺激引起的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和LPS刺激引起的B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。

2.2.2對外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)量的調(diào)節(jié) 由表2可見實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血中T淋巴細(xì)胞數(shù)目與對照組相比明顯增多(P＜0.01)，說明槲皮素可以顯著增加小鼠外周血中T淋巴細(xì)胞數(shù)目。

2.2.3對IgM抗體量的調(diào)節(jié) 從表2可以看出實(shí)驗(yàn)組小鼠IgM抗體生成量含量與對照組相比明顯升高(P＜0.01)，說明槲皮素可以顯著增加小鼠的IgM抗體生成量。

2.2.4對巨噬細(xì)胞吞噬功能的調(diào)節(jié) 由表2可見實(shí)驗(yàn)組小鼠和對照組小鼠相比，其吞噬指數(shù)明顯增加(P＜0.01)，說明槲皮素可以顯著增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬活性。

3 討論

正常的動(dòng)情周期是雌性哺乳動(dòng)物生殖功能成熟的標(biāo)志，維持正常的動(dòng)情周期是小鼠子宮建立接受態(tài)的必要條件，但至今對于子宮周期性變化的分子機(jī)制仍不明了，但可以肯定的是，這種變化是伴隨卵巢激素水平的改變而發(fā)生的，并同時(shí)伴有陰道上皮細(xì)胞學(xué)的周期性改變。動(dòng)情間期、動(dòng)情前期和動(dòng)情期是卵泡形成及排卵期，動(dòng)情后期則黃體形成，并且，隨著子宮由動(dòng)情間期向動(dòng)情期轉(zhuǎn)變，血清中的雌激素，例如雌二醇的水平是逐漸上升的［7］，動(dòng)情周期的變化可以作為反映性激素分泌與代謝活動(dòng)的敏感指標(biāo)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素極顯著地延長了小鼠的動(dòng)情期和動(dòng)情后期，這說明槲皮素在一定程度上調(diào)節(jié)了子宮相關(guān)激素水平，使子宮在組織結(jié)構(gòu)上做出了適應(yīng)胚泡植入需要的調(diào)整。

機(jī)體的免疫應(yīng)答是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，分為T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫。T淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化可以在一定程度上反映機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)，而在體液免疫中IgM是發(fā)生初次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體種類。巨噬細(xì)胞不僅是非特異免疫中的重要吞噬細(xì)胞，而且是特異性免疫中起關(guān)鍵作用的抗原呈遞細(xì)胞，還可通過分泌多種細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)過程［8］。從本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，槲皮素在以上多個(gè)方面對小鼠的免疫功能造成了影響，它顯著地增加了外周血中T淋巴細(xì)胞數(shù)量和IgM生成量，增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的吞噬活性以及由有絲分裂原ConA和LPS刺激所導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞母細(xì)胞化，使其轉(zhuǎn)化為效應(yīng)細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子，發(fā)揮其正常的免疫效應(yīng)。這些結(jié)果表明槲皮素對小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫均具有增強(qiáng)作用。結(jié)合槲皮素對動(dòng)情周期的影響，如前所述，卵子形成和性激素分泌的周期性波動(dòng)影響著動(dòng)情周期的形成，同樣，與神經(jīng)內(nèi)分泌同屬機(jī)體調(diào)節(jié)系統(tǒng)的免疫系統(tǒng)也直接或間接的受激素的調(diào)節(jié)，已有研究證實(shí)，雌激素是一種多克隆的B細(xì)胞激活劑，同時(shí)可以維持胸腺中T細(xì)胞的發(fā)育［9］，因此我們推測，槲皮素或許可以影響相關(guān)激素水平，激素或通過與靶細(xì)胞上特異性受體結(jié)合而發(fā)揮作用，或通過上調(diào)下調(diào)細(xì)胞因子來誘導(dǎo)相應(yīng)細(xì)胞的活化，從而產(chǎn)生了包括動(dòng)情周期和免疫功能在內(nèi)的生理活動(dòng)的改變。然而，母胎耐受這一天然免疫抑制的發(fā)生及維持更應(yīng)與子宮這個(gè)特殊微環(huán)境中各類細(xì)胞的功能活動(dòng)變化密切相關(guān)，因此，在確定槲皮素對小鼠動(dòng)情周期和免疫功能的影響后，我們將研究其對子宮組織中重要免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，從而在機(jī)體和子宮局部兩個(gè)水平探討其生殖免疫學(xué)效應(yīng)及可能的作用機(jī)制。

值得一提的是，目前，眾多研究者在中藥免疫調(diào)節(jié)劑的篩選中總有從具有某種免疫效應(yīng)的整藥中獲得的藥用成分必然會(huì)發(fā)揮同樣免疫效應(yīng)的思路。然而，中藥整藥的藥效是其各種發(fā)揮不同藥理效應(yīng)的單體成分協(xié)同作用的復(fù)雜結(jié)果，本文的研究結(jié)果的確也證明了槲皮素對小鼠的免疫增強(qiáng)作用與含槲皮素成分的水紅花子整藥的免疫抑制作用(結(jié)果已發(fā)表)恰好相反，這為中藥免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)提供了新的科學(xué)參考，而這種在單體成分和整藥水平兩個(gè)層次上作用不同的獨(dú)特的免疫學(xué)現(xiàn)象及機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

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