王 鶴 于繼云 李 力 (廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧530021)

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，全球每年約有50萬(wàn)新增病例，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，僅次于乳腺癌。過(guò)去15年的流行病學(xué)和病毒學(xué)資料已經(jīng)證明：人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的首要因素，且為始動(dòng)因素。幾乎所有宮頸癌細(xì)胞中都有HPV DNA和病毒轉(zhuǎn)化蛋白的表達(dá)。雖然根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全世界80%的宮頸癌與4個(gè)高危型16，18，31和45相關(guān)，但據(jù)我國(guó)最近完成的兩項(xiàng)中國(guó)與亞洲婦女子宮頸中HPV型別分布的Meta研究結(jié)果顯示［1］：HPV58型在我國(guó)宮頸癌婦女中是繼HPV16和18之后的第三重要型別。由于HPV58型分布具有較強(qiáng)的區(qū)域性，僅在亞洲婦女中檢出率較高，因此，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于HPV58的研究還較少。鑒于HPV58型在我國(guó)宮頸癌發(fā)病中的特殊地位，HPV58型疫苗研制是非常必要的。HPV的E6、E7基因在鱗狀上皮病變和宮頸癌中是持續(xù)表達(dá)的，這種持續(xù)表達(dá)既是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化和維持惡性特征所必需，也可作為抗原持續(xù)刺激受感染者的免疫系統(tǒng)，因此成為研制HPV感染相關(guān)宮頸癌及癌前病變治療性疫苗的理想靶抗原［2］。但因E6和E7是癌蛋白，具有轉(zhuǎn)化活性，為保證疫苗在人體內(nèi)的使用安全，必須首先去除E6和E7的轉(zhuǎn)化活性并保留其抗原性。我們?cè)谇捌谘芯恐幸严鼿PV58型E6、E7基因轉(zhuǎn)化活性，本研究隨后構(gòu)建出上游表達(dá)融合抗原HPV58mE6E7和人IgG Fc段、下游表達(dá)分子佐劑hIL12的新型復(fù)合DNA疫苗載體PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12，并采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光及ELISA分別檢測(cè)該疫苗載體的真核表達(dá)情況，為該疫苗載體的療效研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株 點(diǎn)突變后的pGEM-T easy/HPV58mE6E7質(zhì)粒由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成;真核表達(dá)載體 pCI-Fc-GPI、疫苗載體PVAX1-IRES-hIL12由本室自行構(gòu)建保存;大腸桿菌DH5α和人胚腎細(xì)胞293T由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2工具酶和試劑 Ex Taq DNA聚合酶、SolutionⅠ快速連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品;DNA限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA片段凝膠回收試劑盒和DNA片段純化試劑盒均購(gòu)自北京三博遠(yuǎn)志科技公司;DNA電泳用瓊脂糖購(gòu)自BIOWEST AGAROSE公司;G418購(gòu)自Merker公司;氨芐青霉素、卡那霉素、青霉素和鏈霉素為華北制藥有限公司產(chǎn)品;轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒小量提取試劑盒(Wizard?Plusminipreps DNA Purification system)購(gòu)自Promega公司;細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000 Reagent購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.3抗體和試劑盒 鼠抗HPV16 E7單克隆抗體和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司;FITC標(biāo)記的山羊抗人IgG購(gòu)自北京中杉金橋技術(shù)有限公司;人白介素12 ELISA檢測(cè)試劑盒為深圳達(dá)科為有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1HPV58mE6E7融合基因的獲得 點(diǎn)突變后的HPV58mE6E7融合基因序列交由北京擎科生物技術(shù)有限公司全基因合成(片段上下游分別帶有XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn))并連接到pGEM-T easy載體，構(gòu)建成功pGEM-T easy/HPV58mE6E7質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定。

1.2.2重組質(zhì)粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI的構(gòu)建及鑒定 pGEM-T easy/HPV58mE6E7質(zhì)粒與pCI-Fc-GPI真核表達(dá)載體同時(shí)用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切體系為 50 μl：底物 10 μl、Buffer EcoRⅠ 5 μl、XhoⅠ 1 μl、EcoR Ⅰ 1 μl、100 × BSA 0.5 μl、水 32.5 μl。雙酶切后的 HPV58E6E7 融合基因片段和pCI-Fc-GPI載體分別純化回收后經(jīng)SolutionⅠ快速連接酶連接后轉(zhuǎn)化入E．coli.DH5α感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)氨芐青霉素培養(yǎng)皿篩選，挑取陽(yáng)性克隆搖菌提質(zhì)粒，進(jìn)行XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，陽(yáng)性者送公司測(cè)序，最終鑒定正確者命名為pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI。

1.2.3重組疫苗質(zhì)粒PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-hIL12(簡(jiǎn)稱 PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12)的構(gòu)建及鑒定 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI和本室前期構(gòu)建的新型疫苗載體PVAX1-IRES-hIL12分別先用NotⅠ和ClaⅠ單酶切，純化后用Klenow酶補(bǔ)平，再用NheⅠ單酶切后切膠回收分別得到sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI片段和載體。將片段和載體用SolutionⅠ快速連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E．coli DH5α，經(jīng)卡那霉素培養(yǎng)皿篩選后，挑選陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，進(jìn)行NheⅠ和PvuⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確者送公司測(cè)序，最終鑒定正確者即為復(fù)合基因DNA疫苗PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-hIL12，簡(jiǎn) 稱 PVAX1-HPV58mE6E7 Fc-hIL12。

1.2.4重組質(zhì)粒PVAX1-HPV58mE6E7 Fc-hIL12的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 真核表達(dá)采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，胰酶/EDTA常規(guī)消化后接種于6孔培養(yǎng)板中，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后待其匯合度達(dá)到70% ～80%時(shí)，提取鑒定正確的重組質(zhì)粒PVAX1-HPV58mE6E7 FchIL12，在脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，空白對(duì)照組只加入等量的空白脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染完畢后將細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)更換含有10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48小時(shí)收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PVAX1-HPV58mE6E7FchIL12中sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI的表達(dá) ①收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)的293T細(xì)胞，用4℃預(yù)冷含2%小牛血清的PBS 1ml重懸細(xì)胞(轉(zhuǎn)入EP管進(jìn)行后續(xù)操作)，洗滌細(xì)胞2次(不用間隔)，5 000 r/min×20秒，離心去上清;②同時(shí)加入由PBS按1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體100 μl和1∶200稀釋PE標(biāo)記兔抗人B7.1抗體100 μl，混勻，冰浴，避光輕度震蕩30分鐘;5000 r/min×30秒，離心去上清;③4℃預(yù)冷含2%小牛血清的PBS 500 μl洗滌2次，冰浴震蕩，間隔3～5分鐘，5 000 r/min×30秒，離心去上清;④加入1%多聚甲醛500 μl固定后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2.6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)的293T細(xì)胞，按照1.2.5中所述步驟染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察表達(dá)情況并拍照。

1.2.7hIL12分泌表達(dá)的驗(yàn)證 檢測(cè)PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12重組質(zhì)粒中 IRES下游的hIL12的表達(dá)：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，3 000 r/min離心20分鐘吸取上清，以空白細(xì)胞培養(yǎng)上清作為對(duì)照，將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的上清分別稀釋5倍后，按達(dá)科為有限責(zé)任公司人白介素12 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行操作，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，顯色后用Bio-RAD酶標(biāo)儀450 nm讀取OD值，并做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清中hIL12濃度。

2 結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI的構(gòu)建及鑒定 重組質(zhì)粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI經(jīng)XhoⅠ 和 EcoRⅠ雙酶切后，可切下大小為753 bp的HPV58mE6E7目的基因片段(圖1)。

2.2復(fù)合DNA疫苗載體PVAX1-HPV58mE6E7FchIL12的構(gòu)建及鑒定 基因片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI與載體PVAX1-IRES-hIL12連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒后經(jīng)NheⅠ和PvuⅠ雙酶切鑒定證實(shí)，目的基因sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI(2.2 kB)已連入PVAX1-IRES-hIL12中(見(jiàn)圖2)，重組質(zhì)粒送測(cè)序證實(shí)PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-hIL12 DNA疫苗構(gòu)建成功，簡(jiǎn)稱為PVAX1-HPV58m E6E7Fc-hIL12。

2.3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的293T細(xì)胞經(jīng)過(guò)同方法1.2.5的抗體染色后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示：A為空白293T細(xì)胞對(duì)照，B為轉(zhuǎn)染PVAX1-HPV58mE6E7F c-hIL12質(zhì)粒的293T細(xì)胞。從B圖可見(jiàn)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的細(xì)胞(表達(dá)sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI)的表達(dá)率為16.71%。

2.4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè) 在我們構(gòu)建的 PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12重組質(zhì)粒中，HPV58mE6E7基因的羧基端融合了人IgG Fc段基因，可作為檢測(cè)融合蛋白表達(dá)的標(biāo)簽。用FITC標(biāo)記(綠色熒光)的山羊抗人IgG抗體與轉(zhuǎn)染PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12質(zhì)粒48小時(shí)后的293T細(xì)胞進(jìn)行孵育，可檢測(cè)IRES上游插入的融合基因sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI在細(xì)胞中的表達(dá)情況。經(jīng)熒光顯微鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染細(xì)胞有綠色熒光顯示，主要分布于細(xì)胞膜上(圖 4)，證明插入片段 sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI能夠有效表達(dá)。

圖2 PVAX1-HPV58mE6E7c-hIL12質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig．2 Resnicnon enzyme digestion of PVAX1-HPV58m E6E7c-hIL12

圖3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PVAX1-HPV58mE6E7c-hIL12的293T細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Fig．3 FACS analysis in transfected PVAX-HPV58mE6E7 Fc-hIL12 293T cell line

2.5hIL12的分泌表達(dá) IRES下游的插入片段hIL12主要為分泌表達(dá)，因此，需用ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清了解其表達(dá)情況。按達(dá)科為有限責(zé)任公司人白介素12 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行操作，顯色后用Bio-RAD酶標(biāo)儀450 nm讀取OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到濃度與OD值的線性關(guān)系為y=240.2x(r2=0.978 3)，陰性對(duì)照的OD值為0.04，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)上清的OD值平均值分別為2.489，計(jì)算得到hIL12的濃度分別為597.86 pg/ml，陰性對(duì)照的濃度為9.60 pg/ml，見(jiàn)圖5。

圖4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PVAX1-HPV58mE6E7c-hIL12的293T細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)(物鏡，×40)Fig．4 Immunofluorescence assay in transfected PVAX1-HPV58mE6E7c-hIL12 293T cell line FITC(Objective，×40)

圖5 hIL12分泌表達(dá)ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig．5 ELISA showing expression of hIL12

3 討論

DNA疫苗是近年來(lái)出現(xiàn)的一種針對(duì)惡性腫瘤的新型治療方法，它將編碼特異性抗原的基因片段插入到真核表達(dá)載體中，通過(guò)一定的途徑進(jìn)入人體后，即被宿主細(xì)胞攝取，并轉(zhuǎn)錄和翻譯出目的抗原多肽或蛋白，從而誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答［3］。由于DNA疫苗既具有重組亞單位疫苗的安全性又可以像減毒活疫苗那樣誘導(dǎo)全譜性免疫應(yīng)答，包括產(chǎn)生特異性抗體、CD4+Th和CD8+CTL免疫應(yīng)答，因此目前已經(jīng)成為腫瘤免疫治療中極具吸引力的疫苗類型。近年來(lái)，大量研究表明HPV感染是宮頸癌及癌前病變發(fā)生的重要因素，90%以上的宮頸癌患者中可檢測(cè)到HPV DNA的存在。由于HPV病毒本身可引起機(jī)體較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，因此，在宮頸癌及癌前病變的防治中，除傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療等手段外，免疫治療也越來(lái)越受到重視。目前，預(yù)防性HPV疫苗的研究方面已取得較好進(jìn)展，由德國(guó)Merk公司研制的HPV6/11/16/18四聯(lián)疫苗已經(jīng)上市，并在預(yù)防HPV感染上取得較好效果。而治療性HPV疫苗的療效欠佳，尚需做進(jìn)一步研究。選擇恰當(dāng)?shù)闹委煱悬c(diǎn)是構(gòu)建DNA疫苗的一個(gè)關(guān)鍵之處。由于HPV E6、E7基因的強(qiáng)抗原性，因此目前仍是研制HPV感染相關(guān)宮頸癌及癌前病變治療性DNA疫苗的理想靶抗原。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12復(fù)合DNA疫苗載體，利用雙順?lè)醋颖磉_(dá)元件IRES的連接，在表達(dá)上游的融合抗原sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI的同時(shí)，還能表達(dá)下游的分子佐劑hIL-12，二者具有協(xié)同免疫作用。其中，IRES上游的sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI融合抗原片段分子量較單獨(dú)的E6或E7抗原變大，因此所得抗原蛋白的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。并且，與HPV58mE6E7抗原融合表達(dá)的人IgG Fc段能與免疫效應(yīng)細(xì)胞表面的Fcγ受體結(jié)合進(jìn)而激活它們，增強(qiáng)抗原呈遞功能，發(fā)揮其調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用以及激活吞噬細(xì)胞的作用等，同時(shí)還可以延長(zhǎng)重組蛋白的半衰期，提高疫苗的療效［4］;同時(shí)帶有 Fc段的嵌合蛋白，還可以將Fc段作為檢測(cè)標(biāo)簽，對(duì)該蛋白質(zhì)的鑒定和純化帶來(lái)了很大的方便，特別是在沒(méi)有HPV58E6、E7蛋白商業(yè)化抗體的情況下優(yōu)勢(shì)更為明顯。GPI錨定蛋白是一類通過(guò)其羧基末端的糖基化磷脂酰肌(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)結(jié)構(gòu)錨定于真核細(xì)胞膜表面的蛋白。完整的GPI分子轉(zhuǎn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)后能與新生蛋白連接形成GPI錨定蛋白，當(dāng)它與細(xì)胞共同孵育時(shí)，可自動(dòng)整合至細(xì)胞膜表面，并可保持其生物學(xué)活性［5］。本研究利用GPI的目的，就是要將表達(dá)的腫瘤抗原錨定在細(xì)胞膜上，從而達(dá)到增強(qiáng)免疫識(shí)別的作用。因?yàn)槟壳暗难芯勘砻?，以膜形式表達(dá)的抗原要比分泌形式表達(dá)的抗原，在激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力上有更大優(yōu)勢(shì)。hIL12是構(gòu)建腫瘤DNA疫苗中常用的分子佐劑，hIL12既可促進(jìn)NK細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞增殖和活化，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還能分泌GM-CSF、IL2、TNF-α等多種細(xì)胞因子，間接增強(qiáng)免疫［6，7］。

總之，本研究成功構(gòu)建并表達(dá)了 PVAX1-HPV58mE6E7Fc-HIL12復(fù)合DNA疫苗載體，該疫苗載體通過(guò)錨定蛋白GPI將抗原HPV58mE6E7錨定在細(xì)胞表面，有利于增強(qiáng)抗原遞呈;同時(shí)發(fā)揮了人IgG Fc段免疫黏附素、hIL12加強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)的作用。可作為HPV58陽(yáng)性相關(guān)腫瘤及其癌前病變免疫治療的候選疫苗載體。

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