楊猛，何勝菲，任浩，趙蘭娟，戚中田

1. 第二軍醫(yī)大學(xué)研究生管理大隊(duì)臨床十隊(duì)，上海 200433； 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室，上海市醫(yī)學(xué)生物防護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞肝癌及一些自身免疫性疾病，感染人數(shù)約1.7億[1]。然而，治療HCV感染可供選擇的藥物極其有限。α干擾素(interferon α, IFN-α)聯(lián)合利巴韋林是臨床治療丙型肝炎的標(biāo)準(zhǔn)方案。IFN-α作為抗病毒感染的第1道防線，在病毒感染人體后迅速發(fā)揮抑制病毒復(fù)制和增強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用[2]。研究表明，IFN誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與其抗病毒效應(yīng)有關(guān)。IFN與細(xì)胞表面特定受體結(jié)合后啟動(dòng)相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子的經(jīng)典途徑，從而調(diào)節(jié)一系列干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene,ISG)的表達(dá)，發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[3,4]。利巴韋林是于1970年發(fā)現(xiàn)的具有廣譜抗病毒活性的鳥嘌呤類似物，通過抑制鳥嘌呤合成，使病毒缺乏合成RNA所需的鳥嘌呤而無(wú)法復(fù)制。

由于高效體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和合適小動(dòng)物模型的長(zhǎng)期缺乏，阻礙了對(duì)HCV致病機(jī)制的深入了解及抗病毒藥物和疫苗的研制。近年來(lái)，感染性細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的HCV(cell culture-derived HCV, HCVcc)的建立極大地推動(dòng)了HCV致病機(jī)制研究、藥物篩選和疫苗研制工作[5-7]。本研究采用體外培養(yǎng)的感染性病毒HCVcc為研究對(duì)象，比較IFN-α和利巴韋林對(duì)HCV復(fù)制的影響，以及對(duì)干擾素調(diào)節(jié)因子9(interferon regulatory factor 9, IRF9)和ISG15等抗病毒基因的調(diào)節(jié)能力。

1 材料和方法

1.1 主要材料

重組人IFN α-2a 和利巴韋林分別為PBL和Merck產(chǎn)品。DMEM 和胎牛血清為HyClone產(chǎn)品。HCV NS3鼠單克隆抗體(簡(jiǎn)稱單抗)和β-actin抗體分別購(gòu)自Abcam和Cell Signaling Technology公司。HCV E2鼠單抗由Chiron公司Dr. Houghton提供。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)-羊抗兔或抗鼠抗體和TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑為Millipore產(chǎn)品。莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品。SYBR Green PCR Kit 購(gòu)自百泰克公司。Huh7.5.1細(xì)胞和HCVcc(J6/JFH1，基因型2a)由本實(shí)驗(yàn)室提供，其中HCV 2a J6/JFH株全長(zhǎng)基因組質(zhì)粒FL-J6/JFH1由美國(guó)洛克菲勒大學(xué)HCV研究中心Dr. Rice教授惠贈(zèng)。HCVcc的制備及效價(jià)測(cè)定參見文獻(xiàn)[8]。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)Huh7.5.1細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液中添加2 mmol/LL-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、100 μg/ml鏈霉素和100 u/ml青霉素。

1.2.2IFN和利巴韋林處理細(xì)胞Huh7.5.1細(xì)胞種植于24孔板內(nèi)培養(yǎng)過夜，吸棄培養(yǎng)液，用磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗1次；將1×105FFU/ml HCVcc以30 μl/孔于37 ℃培養(yǎng)2 h，吸棄病毒液，用PBS洗1次。將含不同濃度IFN-α(0、100、200、400、800、1 000 u/ml用于檢測(cè)HCV RNA，5、10、20、40、80、100 u/ml用于檢測(cè)抗病毒基因水平)和利巴韋林(0、1、20、100 μg/ml用于檢測(cè)HCV RNA水平和蛋白表達(dá)，1、5 μg/ml用于檢測(cè)抗病毒基因水平)的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基加入孔內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h或96 h。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后分別制備RNA和蛋白樣品，用于實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction， PCR)和蛋白免疫印跡檢測(cè)。

1.2.3引物合成HCV 5′非編碼區(qū)上游引物：5′-CTTCACGCAGAAAGCGTCTA-3′；下游引物：5′-CAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3′；下游引物：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3′。IRF9上游引物：5′-CCACCGAAGTTCCAGGTA-ACAC-3′；下游引物：5′-AGTCTGCTCCAGCAA-GTATCGG-3′。ISG15上游引物：5′-CTCTGA-GCATCCTGGTGAGGAA-3′；下游引物：5′-AA-GGTCAGCCAGAACAGGTCGT-3′。上述引物委托上海英駿生物技術(shù)公司合成。

1.2.4實(shí)時(shí)PCR用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件：1 μg RNA，DEPC水補(bǔ)至10 μl，與100 μmol/L隨機(jī)引物 1 μl混勻，于70 ℃水浴5 min，立即冰浴2 min；然后加入5×M-MLV Buffer 5 μl、10 mmol/L dNTP 1.5 μl、M-MLV 1 μl，DEPC水補(bǔ)至25 μl，混勻于37 ℃水浴1 h以合成cDNA。以上述cDNA作為模板，分別擴(kuò)增HCV、IRF9、ISG15和GAPDH。反應(yīng)體系和條件：cDNA模板 2 μl、2×SYBR Green I 10 μl、上游引物(10 μmol/L)0.4 μl、下游引物(10 μmol/L)0.4 μl、雙蒸水7.2 μl，混勻后用Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 25 s，共40個(gè)循環(huán)。選定未處理組細(xì)胞樣品作為對(duì)照，經(jīng)內(nèi)參GAPDH均一化處理，用DeltaDelta CT Relative Quantitation進(jìn)行相對(duì)定量分析。所用軟件為Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.1。

1.2.5蛋白免疫印跡法蛋白樣品制備參見文獻(xiàn)[9]。樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5% 脫脂奶粉封閉1 h；膜與HCV NS3鼠單抗(1∶1 000)、HCV E2鼠單抗(1∶500)或β-actin抗體(1∶1 000)于4 ℃過夜，與1∶1 000稀釋的HRP-羊抗兔或抗鼠抗體于室溫孵育1 h。ECL試劑顯影，并用GeneGnome HR image capture獲取圖像。所用軟件為GeneTools from SynGene。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量IFN-α對(duì)HCV RNA水平的影響

首先評(píng)估IFN-α對(duì)HCVcc在Huh7.5.1細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的影響。將HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞用含不同濃度IFN-α(0、100、200、400、800、1 000 u/ml)的培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，并抽提細(xì)胞RNA；然后采用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)HCV RNA。圖1表明，100 u/ml IFN-α可顯著降低HCV RNA水平(P<0.05)。

Huh7.5.1 cells infected with HCVcc were cultured in the media containing IFN-α at the indicated doses. Real-time PCR was performed on the extracted RNA. HCV RNA levels are shown as relative percentages of the IFN-α-untreated control. The data are expressed as the mean value and the standard deviation of triplicate experiments.

2.2 利巴韋林和IFN-α對(duì)HCV RNA水平及蛋白表達(dá)的影響

將HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞用含不同濃度利巴韋林(0、1、20、100 μg/ml)的培養(yǎng)液培養(yǎng)96 h，采用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)細(xì)胞RNA 中HCV RNA水平。圖2A顯示，利巴韋林劑量依賴性抑制HCV復(fù)制，1 μg/ml利巴韋林可顯著降低HCV RNA水平(P<0.05)；且100 u/ml IFN-α聯(lián)合利巴韋林對(duì)HCV的復(fù)制具有協(xié)同抑制作用，表現(xiàn)為HCV RNA水平顯著降低(P<0.05)。進(jìn)一步采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)HCV蛋白在上述處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，HCV NS3和E2在HCVcc感染的Huh7.5.1 細(xì)胞中均表達(dá)，而在未感染細(xì)胞中無(wú)表達(dá)；利巴韋林對(duì)NS3和E2表達(dá)的抑制亦呈劑量依賴性，100 μg/ml利巴韋林或其與100 u/ml IFN-α聯(lián)合應(yīng)用可完全抑制NS3和E2表達(dá)(圖2B)。

A: Huh7.5.1 cells infected with HCVcc were cultured in the media containing various doses of ribavirin or in combination with 100 u/ml IFN-α. Real-time PCR was performed on the extracted RNA. HCV RNA levels are shown as relative percentages of the HCVcc-untreated control. The data are expressed as the mean value and the standard deviation of triplicate experiments. *P<0.05 compared with the untreated control. B: Western blot analysis of HCV NS3 and E2 protein expressions was carried out on protein extracts from the Huh7.5.1 cells treated with ribavirin or IFN-α. β-actin is shown as a loading control. One representative experiment out of two is shown.

2.3 不同劑量IFN-α誘導(dǎo)IRF9和ISG15水平的比較

將檢測(cè)IRF9和ISG15水平作為衡量IFN誘生抗病毒基因能力的指標(biāo)。HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞用含低劑量IFN-α的培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h后，抽提細(xì)胞RNA。實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞，5～80 u/ml IFN-α可劑量依賴性誘生IRF9(圖3A)。與IRF9相似，ISG15也被5～80 u/ml IFN-α劑量依賴性促進(jìn)誘生，且ISG15水平增加明顯高于IRF9(圖3B)。有趣的是，100 u/ml IFN-α卻導(dǎo)致IRF9和ISG15水平開始降低。

Huh7.5.1 cells infected with HCVcc were cultured in the media containing various doses of IFN-α. Real-time PCR was performed on the extracted RNA. mRNA levels of IRF9 (A) and ISG15 (B) after 72 h treatment with IFN-α in cells with and without HCVcc infection were detected. The data are expressed as the mean value and the standard deviation of triplicate experiments.

2.4 不同劑量利巴韋林聯(lián)合IFN-α誘導(dǎo)IRF9和ISG15水平的比較

繼續(xù)研究利巴韋林單獨(dú)及聯(lián)合IFN-α對(duì)IRF9和ISG15的影響。結(jié)果如圖4所示，在HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞，用1和5 μg/ml利巴韋林孵育96 h并不促進(jìn)IRF9和ISG15水平升高；用20 u/ml IFN-α孵育則明顯促進(jìn)IRF9和ISG15水平升高；而利巴韋林聯(lián)合IFN-α對(duì)IRF9和ISG15誘生無(wú)促進(jìn)作用。

Huh7.5.1 cells infected with HCVcc were cultured in the media containing various doses of ribavirin and IFN-α. Real-time PCR was performed on the extracted RNA. mRNA levels of IRF9 (A) and ISG15 (B) after 96 h treatment with ribavirin in cells with and without HCVcc infection were detected. The data are expressed as the mean value and the standard deviation of triplicate experiments.

3 討論

目前，主要采用IFN聯(lián)合利巴韋林治療HCV感染。慢性HCV感染患者對(duì)該方案的持續(xù)病毒應(yīng)答率平均為47%～54%，其中HCV基因1型約為40%，而基因2型為85%～90%，表現(xiàn)出較好的臨床效應(yīng)[10,11]。為進(jìn)一步比較IFN-α和利巴韋林的抗病毒效應(yīng)，本研究采用可模擬病毒天然感染的體外培養(yǎng)HCVcc為研究對(duì)象，探討IFN-α、利巴韋林單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HCV RNA水平、蛋白表達(dá)及抗病毒基因的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IFN-α和利巴韋林劑量依賴性抑制HCV復(fù)制，且IFN-α聯(lián)合利巴韋林對(duì)HCV RNA水平及HCV NS3和E2蛋白表達(dá)具有協(xié)同抑制作用。此外，IFN-α可誘生IRF9和ISG15，而利巴韋林并不提高兩者的水平。

IFN聯(lián)合利巴韋林治療HCV感染表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病毒效應(yīng)，闡明兩者的抗病毒分子機(jī)制對(duì)提高療效具有重要意義。Rice等利用含全長(zhǎng)HCV 1b復(fù)制子的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，比較IFN-α和IFN-λ對(duì)HCV復(fù)制的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者劑量依賴性抑制HCV復(fù)制[12]。有臨床資料表明，對(duì)于感染HCV基因1型的患者，利巴韋林劑量為1 000 mg/d(體重≤75 kg)或1 200 mg/d(體重>75 kg)；對(duì)于感染其他基因型的絕大多數(shù)患者，利巴韋林劑量為800 mg/d即可維持滿意的持續(xù)病毒應(yīng)答率[13]。本實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步研究IFN-α和(或)利巴韋林對(duì)感染性病毒HCVcc復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，100 u/ml IFN-α可顯著降低HCV RNA水平。利巴韋林不僅劑量依賴性降低HCV RNA水平，還對(duì)NS3和E2蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性抑制。此外，IFN-α聯(lián)合利巴韋林對(duì)HCV RNA水平和蛋白表達(dá)均有協(xié)同抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅與相關(guān)報(bào)道一致，還深入探討了IFN-α、利巴韋林體外抗病毒作用的量-效關(guān)系。

IFN-α通過誘導(dǎo)一系列具有抗病毒作用的效應(yīng)蛋白表達(dá)，在細(xì)胞內(nèi)建立抗病毒狀態(tài)，抑制病毒復(fù)制，從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[14]。因此，了解抗病毒基因在IFN治療前后的變化，有助于從分子水平闡明IFN治療HCV的機(jī)制。IFN-α持續(xù)作用時(shí)間與某些相關(guān)基因之間的關(guān)系也令人感興趣。聚乙二醇IFN-α治療前后慢性丙型肝炎患者肝臟切片的研究表明，對(duì)IFN-α治療敏感的患者，IFN-α誘導(dǎo)ISG表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)；對(duì)其無(wú)效的患者，治療前ISG已高水平表達(dá)，IFN-α處理并不能使其表達(dá)進(jìn)一步增高[15]。本研究選擇IRF9和ISG15作為評(píng)價(jià)IFN-α抗病毒效應(yīng)的指標(biāo)。結(jié)果顯示，在HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞中，IFN-α在一定范圍內(nèi)劑量依賴性促進(jìn)IRF9和ISG15 mRNA水平升高，且ISG15水平上升高于IRF9；而低劑量利巴韋林并不促進(jìn)兩者mRNA水平上升。此結(jié)果與最近的一篇報(bào)道一致[16]，但對(duì)IRF9和ISG15蛋白表達(dá)水平的影響仍有待研究。此外，100 u/ml IFN-α導(dǎo)致IRF9和ISG15水平開始降低的機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。在前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)1和5 μg/ml利巴韋林聯(lián)合20 u/ml IFN-α對(duì)HCVcc復(fù)制具有協(xié)同抑制作用。本文在兩者協(xié)同抑制HCVcc復(fù)制的基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究低劑量利巴韋林和IFN-α對(duì)ISG表達(dá)的影響(圖4)。結(jié)果表明，利巴韋林聯(lián)合IFN-α對(duì)IRF9和ISG15誘生無(wú)促進(jìn)作用。因此，IFN-α聯(lián)合利巴韋林對(duì)HCV復(fù)制具有協(xié)同抑制作用，但兩者具有不同調(diào)節(jié)抗病毒基因表達(dá)的能力。

綜上所述，本研究初步揭示了IFN-α、利巴韋林體外抗病毒作用的量-效關(guān)系及兩者誘導(dǎo)抗病毒基因的差異。作為大多數(shù)病毒的通用策略，HCV干預(yù)IFN介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制其誘導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)，允許病毒逃逸宿主免疫應(yīng)答，從而建立感染。HCV可能擁有數(shù)種機(jī)制以拮抗IFN或利巴韋林的抗病毒效應(yīng)。HCV與抗病毒藥物相互作用的過程涉及多種病毒、宿主、信號(hào)分子和抗病毒基因產(chǎn)物的綜合作用，深入理解HCV與抗病毒藥物相互作用的分子機(jī)制將提高以IFN為基礎(chǔ)治療方案的療效，形成新的治療措施。

[1] Rehermann B, Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection [J]. Nature, 2005, 5 (3):215-229.

[2] Capobianchi MR, Abbate I, Cappiello G, Solmone M. HCV and interferon: viral strategies for evading innate defence mechanisms in the virus-host battle [J]. Cell Death Differ, 2003, 10(Suppl 1): S22-S24.

[3] Darnell JE Jr, Kerr IM, Stark GR. Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins [J]. Science, 1994, 264 (5164):1415-1421.

[4] Stark GR, Kerr IM, Williams BR, Silverman RH, Schreiber RD. How cells respond to interferons [J]. Annu Rev Biochem, 1998, 67: 227-264.

[5] Kato T, Furusaka A, Miyamoto M, Date T, Yasui K, Hiramoto J,Nagayama K, Tanaka T, Wakita T. Sequence analysis of hepatitis C virus isolated from a fulminant hepatitis patient [J]. J Med Virol, 2001, 64 (3):334-339.

[6] Date T, Kato T, Miyamoto M, Zhao Z, Yasui K, Mizokami M, Wakita T. Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells [J]. J Biol Chem, 2004, 279 (21): 22371-22376.

[7] Kato T, Date T, Murayama A, Morikawa K, Akazawa D, Wakita T. Cell culture and infection system for hepatitis C virus [J]. Nat Protoc, 2006, 1(5):2334-2339.

[8] Tong Y, Zhu Y, Xia X, Liu Y, Feng Y, Hua X, Chen Z, Ding H, Gao L, Wang Y, Feitelson MA, Zhao P, Qi ZT. Tupaia CD81, SR-BI, claudin-1, and occludin support hepatitis C virus infection [J]. J Virol, 2011, 85 (6):2793-2802.

[9] Zhao LJ, Hua X, He SF, Ren H, Qi ZT. Interferon alpha regulates MAPK and STAT1 pathways in human hepatoma cells [J]. Virol J, 2011, 8:157.

[10] Younossi ZM, Baranova A, Afendy A, Collantes R, Stepanova M, Manyam G, Bakshi A, Sigua CL, Chan JP, Iverson AA, Santini CD, Chang SYP. Early gene expression profiles of patients with chronic hepatitis C treated with pegylated interferon-alfa and ribavirin [J]. Hepatology, 2009, 49 (3):763-774.

[11] Gotto J, Dusheiko GM. Hepatitis C and treatment with pegylated interferon and ribavirin [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36 (10):1874-1877.

[12] Marcello T, Grakoui A, Barba-Spaeth G, Machlin ES, Kotenko SV, MacDonald MR, Rice CM. Interferons alpha and lambda inhibit hepatitis C virus replication with distinct signal transduction and gene regulation kinetics [J]. Gastroenterology, 2006, 131 (6):1887-1898.

[13] Reddy KR, Nelson DR, Zeuzem S. Ribavirin: current role in the optimal clinical management of chronic hepatitis C [J]. J Hepatol, 2009, 50 (2):402-411.

[14] Gale M Jr, Foy EM. Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus [J]. Nature, 2005, 436 (7053): 939-945.

[15] Sarasin-Filipowicz M, Oakeley EJ, Duong FH, Christen V, Terracciano L, Filipowicz W, Heim MH. Interferon signaling and treatment outcome in chronic hepatitis C [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105 (19):7034-7039.

[16] Thomas E, Feld JJ, Li Q, Hu Z, Fried MW, Liang TJ. Ribavirin potentiates interferon action by augmenting interferon-stimulated gene induction in hepatitis C virus cell culture models [J]. Hepatology, 2011, 53 (1):32-41.