林光正，裘佳寅，劉叔文，李琳

1. 南方醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，廣州 510515； 2. 南方醫(yī)科大學藥學院，廣州 510515

性傳播是目前人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)傳播的最主要方式，而生殖道及直腸黏膜感染是HIV性傳播的主要途徑。生殖道及直腸黏膜是機體抵抗HIV感染的第1道屏障，此外尚有許多其他屏障系統(tǒng)可抵御HIV在機體內播散，如血-腦屏障及血-視網(wǎng)膜屏障等。但目前HIV感染黏膜及穿透機體自身屏障系統(tǒng)的具體機制尚不明確，HIV黏膜及屏障系統(tǒng)感染的模擬性實驗研究也存在許多局限性。Transwell技術可在體外模擬HIV感染機體黏膜及生物屏障系統(tǒng)，使HIV感染機制的研究能深入展開，在某種程度上能解決上述難題，也為HIV黏膜保護疫苗和藥物的研發(fā)尋找新的作用靶點。

1 Transwell技術概述

Transwell技術是目前細胞生物學中常用的實驗方法之一，在生物醫(yī)學研究領域有著極其廣泛的應用。Transwell小室(Transwell insert)底部是一張具有通透性的膜，一般為聚碳酸酯膜(polycarbonate member)，孔徑為0.1～12.0 μm，該膜體系能滿足細胞在膜內正常生長、繁殖(圖1)。通常將Transwell小室放入細胞培養(yǎng)板中，小室內稱上室(apical chamber)，培養(yǎng)板內稱下室(basolateral chamber)。應用不同孔徑和不同處理的聚碳酸酯膜，可進行細胞共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多方面的研究。Transwell技術主要是根據(jù)不同實驗需求模擬機體生物屏障，以簡單、經(jīng)濟的手段模擬生物體內膜轉運系統(tǒng)，在免疫學、藥理學、藥劑學等領域均發(fā)揮重要作用，尤其是在抗腫瘤研究中起非常重要的作用。目前，研究較多且相對較成熟的生物屏障模擬系統(tǒng)包括血-腦屏障、腸黏膜屏障、血-視網(wǎng)膜屏障、胎盤屏障和腹膜透析屏障等。

圖1 Transwell小室示意圖Fig.1 Transwell insert

2 Transwell技術模擬HIV黏膜感染模型的建立

目前，性傳播已成為HIV傳播的最主要途徑。在性交過程中，HIV感染者體液中的病毒極易透過生殖器黏膜屏障或直腸屏障進入未感染的性伴侶體內，從而造成HIV在體內廣泛傳播。經(jīng)生殖道黏膜和直腸黏膜感染HIV是目前HIV黏膜感染最主要的2種途徑，90%以上HIV感染者均是通過黏膜感染病毒的[1]。有報道指出，HIV從生殖道部位入侵到宿主體內并導致機體系統(tǒng)感染的周期為3～4 d[2,3]。但HIV如何透過黏膜表面進而感染靶細胞？其中又有哪些細胞或因子參與到整個感染過程？很多問題尚待深入研究。因此，研究HIV黏膜感染的作用特點及機制至關重要。

靈長類動物模型無疑是最直觀、有效的研究體系，其在組織結構、免疫和生理等方面均與人類高度相似，能系統(tǒng)、直觀地再現(xiàn)HIV的類似病毒——猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)感染宿主的全過程，為臨床研究提供了很大的參考價值。但其價格昂貴，進行深入的基礎性研究存在困難；且SIV與HIV存在明顯差別，宿主不會出現(xiàn)獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrom，AIDS)，不能完全模擬臨床HIV感染患者的情況，也不適合用來研究發(fā)病機制和評價抗病毒藥物和疫苗。此外，不同地域的靈長類動物，如非洲猴及亞洲猴，感染不同的免疫缺陷病毒株后，其免疫反應、臨床癥狀和發(fā)病情況都存在較大差異，實驗室之間無法將結果進行比較，重現(xiàn)性較低。

采用Transwell技術建立人生殖道黏膜、直腸組織黏膜和細胞模型，體外模擬HIV在生物體內的黏膜感染過程，是目前HIV黏膜感染研究的熱點之一。該模型具有成本低、簡單、易于操作和重現(xiàn)性強等特點，能較為客觀地反映病毒透過黏膜組織或細胞進而感染機體的過程，更容易觀察特定區(qū)域內細胞及相關因子在HIV感染前后的變化，從而客觀分析HIV感染機制的研究，是促進HIV感染機制研究較為有效的手段之一。但是該模型也存在一定的缺點，如黏膜組織和黏膜細胞均屬于離體狀態(tài)，不能完全再現(xiàn)機體病毒感染的復雜全過程。研究表明，Transwell模型在模擬女性生殖道黏膜感染中存在缺陷，因為該模型中HIV可能通過其他方式透過上皮細胞，對其嚴謹性提出質疑[4,5]。雖然Transwell技術在組織及細胞模型中的應用仍存在一定的缺陷和爭議，但不可否認其對HIV作用機制的深入研究可提供幫助。

目前，采用Transwell技術模擬生殖道黏膜及其他屏障系統(tǒng)主要有以下幾種方式。Collins等[6]將人宮頸復層鱗狀上皮組織黏膜置入上室濾膜，采用瓊脂糖凝膠灌注封閉，并留空中心1圈，將病毒與未封閉的黏膜表面接觸來研究其與黏膜組織的相互作用。Shen等[7]則將黏膜組織置入上室，在黏膜面上放置聚丙烯小桶，以外科手術用凝膠將小桶四周封閉。常用細胞模型主要選用原代培養(yǎng)細胞或可永生化傳代的細胞系。如Nazli等[8]利用女性生殖道原代上皮細胞和T84腸道細胞系，建立了生殖道黏膜及腸黏膜Transwell模型，研究了HIV-1對黏膜屏障的損傷作用。Bai等[9]選用人D407視網(wǎng)膜色素上皮細胞系建立血-視網(wǎng)膜屏障模型，研究HIV-1 Tat蛋白對HIV感染黏膜細胞的影響。這些Transwell模型具有各自的優(yōu)缺點，都有一定的應用，但均需進一步完善。

3 Transwell技術在研究HIV黏膜感染中的應用

宿主黏膜基底層中存在大量表面帶有CD4受體的淋巴細胞和巨噬細胞，這些正是HIV作用的靶細胞。有研究表明[10,11]，HIV黏膜感染主要通過黏膜上皮層中的朗格漢斯細胞(Langerhans cell, LC)、樹突細胞(dendritic cell, DC)及M細胞(microfold cell)等，經(jīng)跨膜轉運方式將病毒轉運至基底層的HIV靶細胞。以上研究大多是在動物模型中進行的。Hanley等[12]從血液中分離出DC和T細胞，并對核受體家族中的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARγ)和肝X受體(liver X receptor，LXR)在HIV傳播中的活性作用進行驗證。結果發(fā)現(xiàn)，能激活PPARγ和LXR的藥物可抑制DC捕捉HIV及將HIV傳遞給T細胞的能力。因此，Transwell技術對深入研究HIV經(jīng)黏膜轉運進入機體靶細胞的機制有較大的應用價值。

3.1 生殖道及直腸黏膜上皮細胞

性傳播主要包括異性性傳播及同性性傳播。異性性傳播感染的途徑主要是透過生殖道黏膜屏障，包括子宮頸及陰道黏膜屏障。而透過直腸黏膜屏障是同性性傳播感染的最主要方式。Nazli等[8]用女性生殖道原代上皮細胞和T84腸道細胞系建立生殖道黏膜及腸黏膜的Transwell模型，研究HIV-1破壞黏膜功能的機制。結果發(fā)現(xiàn)，黏膜暴露于HIV顆粒24 h后，Transwell模型的膜跨上皮電阻(transepithelial resistance, TER)降低了30%～60%，生殖道及腸黏膜屏障的通透性增加。進一步研究表明，腸黏膜上皮直接應答于HIV-1包膜糖蛋白，上調炎性細胞因子表達而使屏障功能受損。這一機制可能對研究HIV-1黏膜傳播和免疫激活有幫助。

3.2 濾泡樹突細胞

濾泡樹突細胞(follicular dendritic cell, FDC)存在于二級淋巴組織的生發(fā)中心[13]，與T細胞和B細胞緊密接觸，對免疫記憶的維持，B細胞的分化、成熟及記憶B細胞的形成均具有極其重要的作用[14,15]。研究發(fā)現(xiàn)[16]，F(xiàn)DC細胞是HIV感染的第1道防線。機體感染HIV后，F(xiàn)DC通過細胞表面的DC特異性細胞間黏附分子3結合非整合素因子(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN)吸附大量病毒顆粒，但其本身不被HIV感染，即使在高濃度中和抗體存在下，其吸附的HIV-抗體免疫復合物依然具有很高的感染性[17-20]。另有研究表明，F(xiàn)DC可捕捉HIV，藏于胞內，且在不復制的情況下長期保持活性，條件適宜時病毒又可大量復制[21]。

目前，采用Transwell技術研究FDC對HIV的作用也是研究熱點。姜擁軍等[22]將1×106個淋巴細胞置于Transwell上室，將2×106個FDC置于下室，進行趨化實驗。結果表明，F(xiàn)DC對淋巴細胞有明顯的趨化作用。該實驗還同時評估了FDC對HIV結合及進入淋巴細胞的影響。結果表明，F(xiàn)DC可增強HIV在淋巴細胞內的感染[23,24]，可能原因是其能促進HIV復制。另有研究表明，F(xiàn)DC可延長HIV的體外存活時間[25]。

3.3 T細胞

HIV經(jīng)黏膜上皮細胞轉運到達黏膜下層后，需與靶細胞(即T細胞)特異性結合，進而進入宿主體內。白細胞介素7(interleukin 7，IL-7)是維持外周成熟T細胞穩(wěn)態(tài)的重要調節(jié)因子，在病毒感染后的免疫應答及病毒特異性CD4+和CD8+記憶性T細胞庫的產(chǎn)生及維持過程中發(fā)揮重要作用[26]。對IL-7的特異性應答主要通過CD127表達調控，Vranjkovic等[27]將感染HIV的外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)在Transwell小室中培養(yǎng)，之后將CD8+T細胞暴露于Transwell小室中，結果CD8+T細胞表面CD127表達下降。Lang等則發(fā)現(xiàn)，HIV感染的CD4+T細胞分泌Tat蛋白，通過旁分泌可特異性下調CD127在各型CD8+T細胞中的表達，且這種下調作用是可逆的。效應性CD8+T細胞表面CD127表達下調可促進效應性CD8+T細胞凋亡，記憶性CD8+T細胞耗盡，導致病毒持續(xù)感染[28]。此外，HIV還可對CD4+T細胞表面的CD127表達產(chǎn)生影響。最近研究表明，在HIV感染早期，由于免疫系統(tǒng)活化水平提高及CD4+T細胞凋亡增加，CD4+T細胞表面CD127表達水平降低[29]。CD127在CD4+T細胞表達缺失引起的細胞凋亡及CD127記憶性CD4+T細胞因感染HIV而死亡，是HIV感染中CD4+T細胞缺失的重要原因之一[30]。探究CD127與HIV的關系，為HIV的防治提供了新途徑。

4 Transwell技術在HIV穿透機體其他屏障系統(tǒng)中的應用

4.1 血-腦屏障

血-腦屏障是維持腦內環(huán)境穩(wěn)定和避免有害物質入侵的必需結構，是機體參與天然免疫的內部屏障之一，可保護大腦不被血液中的微生物和毒素傷害[31]。研究表明，20%的AIDS患者感染HIV-1后，HIV-1包膜蛋白gp120可改變血-腦屏障的完整性[32]，病毒會透過血-腦屏障進入大腦，在腦內繁殖并破壞大腦組織，從而產(chǎn)生HIV癡呆癥或其他認知障礙。對HIV穿透血-腦屏障導致功能障礙的機制，目前尚無定論。建立體外血-腦屏障模型對該問題的解決具有重要意義。

Chaudhuri等[33]將感染HIV-1的單核-巨噬細胞和腦微血管內皮細胞在Transwell小室中共培養(yǎng)，觀察HIV基因變化。結果發(fā)現(xiàn)，HIV-1損壞血-腦屏障的機制與腦微血管內皮細胞中的炎癥、細胞因子及干擾素信號有關。Eugenin等[34]研究表明，少數(shù)感染HIV的星狀膠質細胞在中樞神經(jīng)損傷中起重要作用，該毒性機制對研究中樞神經(jīng)損傷和控制HIV導致的認知障礙有較大貢獻。另有研究發(fā)現(xiàn)，來源于腸道細菌細胞壁的化學成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可協(xié)助HIV透過血-腦屏障進入大腦，而HIV感染者血液中LPS含量極高。此外，CD40和CD40配體在HIV透過血-腦屏障過程中也有促進作用[35]，該研究成果為防御HIV侵入大腦提供了實驗依據(jù)。

4.2 血-視網(wǎng)膜屏障

HIV-1 Tat蛋白是HIV基因組編碼的重要調控蛋白之一，為HIV轉錄和復制所必需；且其中蛋白轉導結構域(protein transduction domain，PTD)具有信號肽作用，能有效引導多肽片段或蛋白進入細胞，具有蛋白傳送功能，是目前生物制品中加在蛋白或多肽前促進多肽跨膜轉運的主要序列之一。Bai等[9]選用人D407視網(wǎng)膜色素上皮細胞系建立血-視網(wǎng)膜屏障Transwell模型，用以研究HIV-1 Tat蛋白對其的影響。結果顯示，HIV-1 Tat蛋白能顯著提高視網(wǎng)膜色素上皮細胞膜的通透性，改變某些與致密連接相關蛋白的表達，這一效應可能與某些炎癥因子的激活有關。2011年，李太生等研究發(fā)現(xiàn)[36]，長期接受抗HIV藥物治療的AIDS患者雖然血液中病毒檢測已呈陰性，但其淚液中仍有較高病毒載量，淚腺、淚液及相關組織和器官很可能是HIV的新“據(jù)點”，這也為HIV與血-視網(wǎng)膜屏障的相互作用提供了新的研究方向。

5 結語

隨著全球HIV/AIDS感染人群持續(xù)增長，對HIV感染的防治日益引起人們的重視。目前，性傳播尤其是異性間無保護的性傳播已成為HIV傳播的最主要方式。人體自身存在著一些生理屏障系統(tǒng)，能天然抵抗外來病毒的入侵，如人生殖道及直腸黏膜，這些屏障系統(tǒng)的存在也大大降低了HIV及其他性傳播疾病病原體的感染性。據(jù)報道，天然黏膜屏障系統(tǒng)損傷或炎癥感染患者中，HIV感染率很高。迄今為止，科學家一直致力研究HIV黏膜感染及病毒穿透機體屏障系統(tǒng)的具體機制，但尚未闡釋清楚。HIV直接感染人黏膜及其他屏障系統(tǒng)的相關研究很難操作，其模擬性實驗也存在很多問題。理論上，預防HIV感染的最好手段是開發(fā)成功的HIV疫苗。在目前缺乏有效疫苗且研發(fā)成功的疫苗尚需很長一段時間的情況下，開發(fā)能有效抑制HIV傳播的殺微生物制劑也是有效途徑之一，但靈長類動物模型的缺陷部分限制了疫苗及藥物的研發(fā)。采用Transwell技術在一定程度上為解決這些難題提供了一種方案，可在體外模擬HIV感染機體的黏膜及屏障系統(tǒng)，從而使HIV感染機制及疫苗和抗病毒藥物的研究能深入展開。目前Transwell技術也的確推進了HIV感染機制的研究，如HIV-1對黏膜屏障的損傷作用、FDC對HIV復制的促進作用等。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，陰道而非腸道巨噬細胞允許HIV復制[37]和包皮環(huán)切術能降低HIV感染率[38]等，這些均是Transwell技術研究成果的體現(xiàn)，為深入研究HIV感染機制、HIV黏膜保護疫苗的開發(fā)以及新藥物作用靶點的尋找和確認提供了良好的技術平臺。

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