匡小舟，滕崢，張曦

上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336

腸道病毒和胃腸炎病毒專性寄生于人類胃腸道，引起宿主細(xì)胞感染。其傳播主要通過糞-口途徑，感染病毒的患者可在每克糞便中排泄出105～1011個病毒顆粒[1]，因此在與排泄物直接接觸的原水中病毒濃度往往較高。腸道病毒與胃腸炎病毒自身物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不僅可在人類胃腸道內(nèi)穩(wěn)定生存，在水中存活時間也可長達(dá)數(shù)周[2,3]。雖然它們無法在水中直接復(fù)制，但一旦被攝入人體內(nèi)，即使低劑量也能引起疾病[4]。因此，這些生存于污染環(huán)境水中的病毒對人類健康構(gòu)成潛在威脅。例如，用于農(nóng)業(yè)灌溉與施肥的廢水和污水、污泥就是一種病毒污染農(nóng)作物的可能來源和途徑[5]，世界各地也曾多次出現(xiàn)由水源污染引起暴發(fā)流行的各種病毒性腸道疾病或腹瀉事件[6,7]。

目前的污水處理程序，如活性沉渣處理、氧化塘、活性炭處理、過濾、石灰混凝及加氯，只能消除廢水中50%～90%的病毒[8]，因此一些病毒仍能在污水處理后被排放。大多數(shù)國家對廢水處理系統(tǒng)性能監(jiān)測的指標(biāo)主要依賴于指示性細(xì)菌。我國現(xiàn)行的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749-2006)和廢水再利用中的《再生水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(SL 368-2006)中微生物污染指標(biāo)一欄也只包括了細(xì)菌和寄生蟲的測定標(biāo)準(zhǔn)，并沒有涵蓋對涉水病毒的檢測。但細(xì)菌與病毒污染并不一定有關(guān)聯(lián)[9]，細(xì)菌指標(biāo)的使用不足以用來監(jiān)測和評價已處理水源的水質(zhì)。目前病毒檢測技術(shù)靈敏度不高，常規(guī)方法如熒光反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)只能在樣品含高濃度病毒 (>2×104copies/ml)的情況下才能將其檢出[10]。因此，通常情況下，水樣在前處理過程中只有通過不同技術(shù)手段有效濃縮，才能檢出并證實(shí)所含的污染病毒。在全球不少因病毒污染水源而造成腹瀉暴發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查中，實(shí)驗(yàn)室也都依賴病毒濃縮的方法，最終成功捕獲到致病微生物并還原出原始感染模型。2009年6月，意大利南部的加爾達(dá)湖大酒店出現(xiàn)腹瀉病情，當(dāng)?shù)毓残l(wèi)生署在之后的4周內(nèi)上報(bào)了幾百起病例。實(shí)驗(yàn)室除對患者糞便進(jìn)行檢測外，還采集當(dāng)?shù)厥袇^(qū)的引用水源(即經(jīng)過理化處理的湖水)，將水樣濾膜濃縮，用一步法RT-PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果證實(shí)諾如病毒與這起水體傳播暴發(fā)疫情有明顯關(guān)聯(lián)[11]。1998年在加勒比島上的百慕大度假酒店暴發(fā)腹瀉，影響了包括122名員工在內(nèi)的至少448人。美國亞特蘭大疾病預(yù)防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)實(shí)驗(yàn)室通過濾膜濃縮水源和RT-PCR分析，證明疫情與水箱被攜帶諾如病毒的糞便污染有關(guān)[12]。同年，通過類似對飲用水樣本濃縮處理和RT-PCR檢測，芬蘭也確認(rèn)了1起發(fā)生在黑奈韋西市的腹瀉暴發(fā)是由于市政自來水被諾如病毒污染所致。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，這起事件涉及1 700～3 000例急性胃腸炎病例，再次印證飲用水的氯化處理不足以殺滅水體中的病毒[6]。以上調(diào)查研究都指出，如何對水體樣本進(jìn)行高效的病毒濃縮并對目標(biāo)病原體進(jìn)行特異性檢測是確認(rèn)疫情暴發(fā)起因的決定性因素。

1 腸道病毒與胃腸炎病毒

人腸道病毒屬小核糖核酸病毒科腸道病毒屬[13]，其亞屬包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒(A組、B組)、埃可病毒和一組由血清型號標(biāo)記的腸道病毒(66～71型及新鑒定的73～75、77、78型)。腸道病毒顆粒由小的無包膜二十面體組成，直徑只有27～30 nm?；蚪M由單股正鏈RNA組成，復(fù)制發(fā)生在脊椎動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[14-16]。腸道病毒感染的特點(diǎn)是高異質(zhì)性臨床表現(xiàn)，同一種病毒可引起幾種不同的臨床疾病，而不同腸道病毒也可引起相同的臨床癥狀[14]。脊髓灰質(zhì)炎病毒通常引起亞臨床感染或嚴(yán)重感染，如無菌性腦膜炎和脊髓灰質(zhì)炎(小兒麻痹)[17]?？滤_奇病毒、埃可病毒及其他型別腸道病毒根據(jù)組別會引起不同的疾病癥狀，其中包括上呼吸道和胃腸道感染、黏膜疹、皮疹、皰疹性咽峽炎(手足口病)、出血性結(jié)膜炎，以及更嚴(yán)重的無菌性腦膜炎、腦炎、麻痹、胰島素依賴型糖尿病和心臟疾病[16-18]。

引起人病毒性胃腸炎的病原體主要有輪狀病毒、諾如病毒、札幌病毒、腸道腺病毒(血清型為F亞屬的40、41型)和星狀病毒等[19,20]。其中，輪狀病毒是5歲以下兒童嚴(yán)重腹瀉的主要病原體。在發(fā)展中國家，每年輪狀病毒導(dǎo)致約140萬病例，其中約80萬例死亡，占所有腹瀉入院患者的25%[21]。輪狀病毒為直徑約70 nm、無包膜的二十面體病毒，屬呼腸孤病毒科。病毒顆粒由3層蛋白衣殼包裹的11段雙鏈RNA組成[22]。病毒感染破壞了宿主小腸中上層絨毛上參與絨毛吸收功能的成熟腸上皮細(xì)胞，改變了小腸上皮的功能，助長了分泌型隱窩細(xì)胞的增殖，造成吸收不良性腹瀉[23,24]。其經(jīng)典癥狀是2～3 d的發(fā)熱和嘔吐，后伴有非出血性腹瀉[25]。在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家兒童中，A群輪狀病毒致急性胃腸炎最為常見。目前除通過疫苗接種預(yù)防外，還沒有特定的治療方法[26]。諾如病毒則是引起全球所有年齡組人急性病毒性胃腸炎的重要病原體[27]。諾如病毒和札幌病毒同屬杯狀病毒科，顆粒為無包膜的二十面體，包含1條約7.7 kb的單股正鏈RNA[28]。它引起的暴發(fā)呈季節(jié)性或散發(fā)性特征，尤其是在半封閉社區(qū)，如家庭、學(xué)校、養(yǎng)老院、醫(yī)院、酒店、郵輪等[29]。與其他胃腸炎病毒不同，腸道腺病毒顆粒雖然也是由無包膜的二十面體衣殼組成(直徑約90 nm)，但其基因組為34～48 kb的線性雙鏈DNA[30]。在其纖維和五鄰體衣殼蛋白的介導(dǎo)下，腺病毒感染宿主上皮細(xì)胞(消化道)，可能造成病毒廣泛播散，并在兒童和免疫功能低下者中引起死亡[31]。星狀病毒是引起嬰幼兒急性病毒性腸炎的最重要病原體之一，直徑28～35 nm，無包膜，為單股正鏈RNA[32]。星狀病毒常與輪狀病毒混合感染。與其他胃腸炎病毒相比，其臨床表現(xiàn)較輕，腹瀉持續(xù)時間較短[33]。

2 水樣濃縮方法

與臨床樣本中的病毒載量相比，環(huán)境中的病毒濃度通常較低，因此成功濃縮并檢測到環(huán)境樣品中的致病病毒是一大挑戰(zhàn)。不同國家對如何從水源中濃縮病毒都做了不少研究[34-37]，美國和歐盟也頒布了一系列指導(dǎo)性的標(biāo)準(zhǔn)和方法，如美國的D5244-92、9510及歐盟的BS EN 14486∶2005等。歸納起來，這些方法主要基于2種原理(表1)。一種是經(jīng)離子結(jié)合的濾膜過濾濃縮，另一種是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀。

表1 2種從不同水樣或模擬水樣中濃縮并檢測病毒的病毒濃縮法Tab.1 Two conventional virus enrichment methods for the detection of various viruses from different water samples

2.1 離子結(jié)合濾膜濃縮法

在離子結(jié)合濾膜濃縮病毒的方法中，水中病毒在多價陽離子存在的條件下，可吸附在負(fù)電性濾膜上。這種吸附可能不僅是由病毒、濾膜和陽離子三者間的靜電吸引力引起的，還可能是三者疏水性相互作用的結(jié)果[44]。Lukasik等[44]在濾膜濃縮水中病毒的研究中證實(shí)，陽離子的存在促進(jìn)病毒與濾膜間的疏水性作用，從而加強(qiáng)病毒吸附。此外，這些帶陽離子的鹽類對促進(jìn)病毒吸附的能力還與其自身的化合價有關(guān)。同樣濃度的三價鹽(Al3+)對病毒吸附濾膜的促進(jìn)能力強(qiáng)于二價鹽(Mg2+)，而同樣濃度的二價鹽促進(jìn)吸附的能力又強(qiáng)于單價鹽(Na+)[45,46]。傳統(tǒng)方法中，吸附在濾膜上的病毒可被堿性牛肉浸出液(1%～3%，pH 9～11)洗脫。但由于牛肉浸出液中的有機(jī)或無機(jī)化合物可能會抑制cDNA合成和PCR擴(kuò)增[47,48]，所以另一種洗脫病毒的方法被不少學(xué)者采納，即先用強(qiáng)酸(如H2SO4，pH 3.0)洗膜，然后用強(qiáng)堿(如NaOH，pH 10.8)洗脫病毒[37,38,49]。

2.2 PEG沉淀法

PEG沉淀法在20世紀(jì)60～70年代廣泛運(yùn)用于病毒的濃縮和提純[50-52]。PEG是一種無毒、可溶于水、化學(xué)性質(zhì)為惰性的合成聚合物，可用來沉淀蛋白(也包括由蛋白衣殼包裹的病毒顆粒)。其最主要的作用原理由Atha和Ingham提出：PEG就如“惰性溶液海綿”，在減少空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上將蛋白從溶液中排出，從而有效增加蛋白濃度直至超過其飽和溶解度，最終蛋白從溶液中析出，出現(xiàn)沉淀[53]。此外，還有另一種可能的理論可解釋PEG沉淀現(xiàn)象，即蛋白表面電荷對溶解的PEG產(chǎn)生一種不利的熱學(xué)效應(yīng)，導(dǎo)致PEG從“蛋白區(qū)域”被排斥出來。因此當(dāng)PEG聚合物以適當(dāng)?shù)母邼舛却嬖跁r，蛋白沉淀或蛋白結(jié)晶就會出現(xiàn)[54]。高相對分子質(zhì)量的PEG濃縮、純化病毒的效果比低相對分子質(zhì)量的PEG更有效[41]。

3 檢測方法

3.1 分子生物學(xué)方法

自20世紀(jì)90年代，分子生物學(xué)方法廣泛應(yīng)用于臨床和環(huán)境研究以檢測樣本中的腸道病毒。PCR技術(shù)就是基于病毒基因組中腸道病毒屬部分同源性高度保守區(qū)域而建立的，比傳統(tǒng)借助細(xì)胞培養(yǎng)的檢測分析更具優(yōu)勢。研究證明，PCR擴(kuò)增在診斷腸道病毒感染中快速、特異、敏感[55]。通過使用不同的引物，可檢測不同組或特定血清型的病毒[38]。因此，在樣本稀少或病毒無法在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)的條件下，PCR靈敏度高，是一種可靠的檢測手段[56]。但傳統(tǒng)的PCR對確切估計(jì)測試樣品中的病毒量還有一定局限性，所以一些PCR衍生技術(shù)被開發(fā)并運(yùn)用，如套式PCR、多重PCR和實(shí)時熒光PCR，進(jìn)一步提高了檢測的靈敏度和特異度。

套式PCR使用了2對引物，分別是外部引物(目標(biāo)序列兩端的互補(bǔ)物)和內(nèi)部引物(更接近于中心擴(kuò)增片段的引物)。第1次擴(kuò)增反應(yīng)后，其產(chǎn)物立即作為第2次擴(kuò)增的模板，因而增強(qiáng)了靈敏度和特異度[38,57]。而多重PCR允許用幾對不同引物同時檢測不同類型的病毒，但反應(yīng)產(chǎn)物必須有不同的長度才能被區(qū)分[17]。實(shí)時定量PCR系統(tǒng)，在熒光探針和與目標(biāo)序列互補(bǔ)的淬滅基團(tuán)存在下，可實(shí)現(xiàn)同步監(jiān)測運(yùn)行時的反應(yīng)情況。隨著測得的PCR產(chǎn)物數(shù)量增加，熒光信號隨之加強(qiáng)，并通過圖譜形式呈現(xiàn)在計(jì)算機(jī)上。由于其無法比擬的快速和高特異度，以及可對目標(biāo)病毒基因?qū)崿F(xiàn)半定量測定，不少研究將其用于檢測水體中的腸道病毒[37,55]。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)法

雖然PCR技術(shù)在很大程度上提高了水體中腸道病毒的檢出率，但其無法對樣本中病原體的存活性乃至感染性作出有效評估，此外也無法對不同濃縮病毒方法就病毒活性影響方面作出比較性判斷。因此，病毒培養(yǎng)和分離作為診斷腸道病毒感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，無論是單獨(dú)檢測還是結(jié)合分子生物學(xué)方法綜合判斷，都是一道不可缺少的程序[38,58]。有幾種較常用的、直接基于細(xì)胞培養(yǎng)法測得的指標(biāo)可用于判斷病毒的感染性：一種是病毒在易感細(xì)胞中的半數(shù)感染劑量(50% tissue culture infective dose，TCID50)，另一種則是通過蝕斑試驗(yàn)得到的空斑形成單位(plaque forming unit，PFU)。

傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中，腸道病毒根據(jù)不同型別，可通過RD、HEP-2、L20B、VERO、HeLa、BGM等易感細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)[10,56,57]。當(dāng)選定的細(xì)胞被感染后，CPE的出現(xiàn)就可作為評估病毒是否具有感染性的指標(biāo)之一。TCID50終點(diǎn)稀釋測試量化了殺死50%受感染細(xì)胞或在50%細(xì)胞中出現(xiàn)CPE所需的病毒數(shù)量。值得一提的是，該實(shí)驗(yàn)還可用來評估不能形成蝕斑的病毒感染性。在細(xì)胞培養(yǎng)中，首先將宿主細(xì)胞鋪于培養(yǎng)板上，隨后將經(jīng)連續(xù)稀釋的病毒逐一滴加于不同孔板，孵育后對每個病毒稀釋度觀察并記錄細(xì)胞死亡比例(感染細(xì)胞)，通過公式計(jì)算獲得TCID50值[59]。

基于蝕斑的檢測，就感染劑量而言是判斷病毒濃度所采用的標(biāo)準(zhǔn)方法，用PFU表示。在實(shí)驗(yàn)中，將不同稀釋度的病毒感染單層宿主細(xì)胞，并用半固體培養(yǎng)基覆蓋(如瓊脂或羧甲基纖維素)以有效防止病毒泛濫性蔓延感染。在固定單層細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)病毒感染某個細(xì)胞后，該細(xì)胞會裂解，病毒空斑就此形成[60]。破胞釋放的病毒繼而進(jìn)入相鄰細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)重復(fù)從感染到裂解的周期。被感染的細(xì)胞區(qū)域會形成蝕斑(感染區(qū)被未感染的細(xì)胞包圍)，此現(xiàn)象在指示劑染色后可通過肉眼或光學(xué)顯微鏡觀察到。斑塊的形成可能需要3～14 d，這取決于不同的病毒。斑塊數(shù)量結(jié)合病毒稀釋度，可用來計(jì)算樣本每單位體積的PFU(PFU/ml)。該結(jié)果基于每個斑塊代表1個感染病毒顆粒的假設(shè)，體現(xiàn)了樣本內(nèi)感染顆粒的數(shù)量[59]。由于檢測方法和原理的顯著差異，PFU與TCID50的檢測結(jié)果不等價，PFU能更直接估算出濃縮后樣品中的感染顆粒數(shù)量。

4 結(jié)語

隨著科技發(fā)展，越來越多的研究開始運(yùn)用水體濃縮、純化手段，結(jié)合分子生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)方法，檢測環(huán)境水體樣本中的腸道病毒。這些技術(shù)不但實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)方法無法完成的檢測，填補(bǔ)了傳染病實(shí)驗(yàn)室在檢測環(huán)境標(biāo)本中的技術(shù)空缺，而且為病毒性腸道疾病疫情的流行病學(xué)資料提供了實(shí)質(zhì)性證據(jù)。但是，我國現(xiàn)行的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 》(GB 5749-2006 )和廢水再利用中的《再生水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(SL 368-2006)中微生物污染指標(biāo)一欄只包括細(xì)菌和寄生蟲的測定，沒有涉及水病毒的檢測標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程。因此，這些國內(nèi)外的有關(guān)研究對我國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定部門將有所啟示，為今后疾病預(yù)防和控制單位的實(shí)驗(yàn)研究和應(yīng)用起指導(dǎo)作用。

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