李研，陳省平，賴小敏，王聰，王娟，袁廣卿，彭毅

生物安全三級實驗室是按照我國《病原微生物實驗室生物安全管理條例》[1]和《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）[2]等有關病原微生物實驗室生物安全法規(guī)和標準，以及 WHO《實驗室生物安全手冊》（第三版）[3]中的三級生物安全（biosafty level 3，BSL-3）防護標準建立的病原微生物實驗室，是專門針對通過氣溶膠或其他途徑傳播，可導致嚴重后果或生命危險的內源性和外源性病原而特設的適用于臨床、診斷、教學、科研的設施。高級別生物安全實驗室中所研究的病原體大多數(shù)具有氣溶膠感染的特性[4]。隨著經濟的高速發(fā)展和近年來傳染性非典型肺炎（又稱嚴重急性呼吸綜合癥，severe acute respiratory syndromes，SARS）和高致病性禽流感等疾病的暴發(fā)流行，實驗室生物安全問題受到了社會各界的廣泛關注[5]。如何避免實驗室生物安全問題的產生已成為科研人員高度關注的問題。實驗室的消毒、滅菌是關鍵之一。目前，生物安全實驗室多采用物理及化學的方式來殺滅實驗室內微生物或其他有害病原體。物理的消毒方法主要有紫外線照射、干熱滅菌、壓力蒸汽滅菌、高效空氣過濾器（high efficiency particulate air filter，HEPA 過濾器）過濾等。其中紫外線消毒是大多數(shù)普通生物實驗室采用的消毒方法，但紫外線消毒受很多因素影響，如管理意識、輻射強度、燈管的使用與保養(yǎng)等[6]?；瘜W消毒是使用消毒劑來殺滅病原微生物。在化學消毒劑中，甲醛熏蒸因為具有廣譜殺菌、使用方便和價格低廉等優(yōu)點，已成為國內最為普遍的消毒、滅菌方法[7]。尤其在從事結核分枝桿菌研究的生物安全實驗室中有氣溶膠傳播的特性，采用甲醛熏蒸能針對懸浮在空氣中的小顆粒氣溶膠進行消毒、滅菌。甲醛消毒原理是使病原體蛋白質凝固、還原氨基酸、使蛋白質分子烷基化等[8]。我們按照上述國內外法規(guī)、指南和標準，以及本實驗室《生物安全三級實驗室消毒滅菌手冊》對實驗室進行消毒，用平板培養(yǎng)法和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測法進行消毒效果檢測和驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 自制普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于直徑 9 cm平皿中，經 37 ℃ 24 h 培養(yǎng)驗證無菌后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 甲醛購自廣州化學試劑廠，純度為 37%，用單蒸水配制成 36% 甲醛溶液；DNA 抽提試劑盒購自美國Omega bio-tek公司；Taq DNA 聚合酶、Mg2+購自美國Promega 公司；核酸分子量 marker 購自廣州東盛生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 F-50 型甲醛熏蒸器購自北京克力愛爾生物有限公司；FORMA3111 型二氧化碳水套式培養(yǎng)箱購自美國 Forma 公司；VERITI96-WELL 型 PCR 儀購自美國 ABI 公司；G:BOXEF 凝膠成像系統(tǒng)購自英國 Syngene公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗室消毒 按房間體積計算，以 15 ml/m3比例計算出 36% 甲醛溶液的用量，將定量的甲醛溶液和中和劑氨水分別加入甲醛發(fā)生器內相應的 A 和 B 槽。按照WHO《實驗室生物安全手冊》（第三版）要求，將實驗室室內溫度調節(jié)高于 25 ℃，相對濕度在 70% 左右。確認實驗室內無工作人員后，關閉消毒區(qū)域與外界相通的門和傳遞窗，以及中央送風系統(tǒng)，遙控啟動甲醛發(fā)生器進行熏蒸。房間熏蒸 8 h 以上。熏蒸后不立即通風，房間密閉 24 h 后，打開通風系統(tǒng)置換新鮮空氣，直至聞不到刺鼻甲醛氣味。

1.2.2 消毒滅菌效果平板培養(yǎng)法檢測 實驗室消毒后，用5 個 9 cm 普通平板培養(yǎng)基對實驗室內空氣沉降 15 min采樣。分別置于實驗室的 4 個角落以及中央位置，相當于人的呼吸道高度[9]。將采樣后的平板置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 h 后，計數(shù)菌落數(shù)量。

1.2.3 結核分枝桿菌 PCR 特異性檢測 對實驗室內易污染部位進行甲醛熏蒸消毒前后采樣對比，包括：實驗室門把手、實驗臺面、生物安全柜門把手、顯微鏡調節(jié)旋鈕、二氧化碳培養(yǎng)箱門把手、冰箱門把手、傳遞窗按鈕以及高壓滅菌器開關及把手等。用浸有無菌生理鹽水的棉簽往返5 次擦拭各采樣點后，將棉簽浸入采樣管中。所有采樣標本用 DNA 試劑盒抽提 DNA 后進行 PCR 擴增。PCR 引物序列為：上游引物 5' CAGTGGAATTTCGCGGGTATC 3'，下游引物 5' CGTTGTTCAGCTCGGTAGCC 3'，可特異性擴增 200 bp 左右的結核分枝桿菌早期分泌蛋白 6（ESAT-6）基因片段。PCR 反應體系包含 cDNA 1 μl，dNTP mix（10 mmol/L）0.5 μl，上下游引物各 1 μl（10 μmol/L)，Taq DNA 聚合酶 0.125 μl（5 U/μl），Mg2+（25 mmol）3 μl 和5 × PCR buffer 5 μl，加重蒸水至 25 μl。反應條件：95 ℃5 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，循環(huán) 35 次；最后 72 ℃ 7 min 終止反應。實驗設置陽性和陰性對照。以 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 PCR 產物，凝膠成像儀下觀察記錄結果。

2 結果

2.1 普通平板培養(yǎng)菌落計數(shù)

平板培養(yǎng)后計數(shù)結果顯示，實驗室 4 個角落及中央位置菌落數(shù)分別為 0、2、1、0、0。符合生物安全三級實驗室的消毒滅菌要求。

2.2 PCR 擴增結核分枝桿菌基因片段結果

圖 1 為消毒前 PCR 擴增結核分枝桿菌基因片段結果。陽性對照（2 號加樣孔）和生物安全柜操作臺面（4 號加樣孔）有約為 200 bp 左右的陽性擴增片段，其余各取樣擴增管（3、5 ～ 10 號加樣孔）及陰性對照（1 號加樣孔）未見陽性擴增片段，說明熏蒸前實驗操作臺面有污染。

圖 2 為熏蒸后 PCR 擴增結核分枝桿菌基因片段結果。陽性對照（2 號加樣孔）可見 200 bp 左右的擴增片段，但各取樣擴增管（3 ～ 10 號加樣孔）及陰性對照（1 號加樣孔）未見擴增片段，說明熏蒸消毒、滅菌后各取樣點未檢測到結核分枝桿菌核酸序列，提示實驗室已無細菌污染，達到消毒滅菌效果。

3 討論

圖 1 熏蒸前 PCR 擴增結核分枝桿菌基因片段結果

圖 2 熏蒸后 PCR 擴增結核分枝桿菌基因片段結果

目前生物安全三級實驗室通過送排風系統(tǒng)并經過初、中、高效過濾器過濾，保證了實驗室內空氣潔凈度為萬級到十萬級；同時輔助工作區(qū)與緩沖間之間，以及緩沖間與核心實驗室之間形成國家標準要求的負壓（遞增）梯度現(xiàn)狀，能夠為實驗室內工作人員提供有效的生物防護。但在開展實驗活動時難免會有操作臺面等的污染。因此，我們進行了甲醛熏蒸消毒滅菌效果驗證的系統(tǒng)研究。通過瓊脂平板培養(yǎng)實驗和 PCR 檢測驗證了甲醛熏蒸消毒的有效性。前者根據消毒滅菌操作后實驗室空間普通細菌殘留的數(shù)量間接檢測消毒滅菌的效果，但由于受實驗室本身潔凈度等因素的影響，這種方法只能作為消毒滅菌效果驗證的初步和補充方法；而后者由于能特異性檢測所操作的病原體核酸，具有方法簡便、快速、特異、敏感等特點[10]，可作為實驗室空間及儀器設備污染與否和消毒滅菌效果驗證最為準確的方法，實際操作時可選擇在每次、周、月實驗結束清場（消毒滅菌）后定期和不定期，以及一個實驗周期結束后終末消毒滅菌效果驗證時進行。應注意取樣點的代表性和完整性，同時定期和不定期配合使用特定病原體的培養(yǎng)方法作補充。甲醛是一種高效的消毒劑，可通過熏蒸發(fā)生，使用起來簡單、方便、有效，對消毒物品無損害。但由于甲醛消毒效果受消毒環(huán)境的溫度、濕度、工作濃度以及熏蒸時間等因素的影響[4]，因此，在消毒時要嚴格控制條件以達到良好的消毒、滅菌效果。此外，因甲醛消毒后會有殘留，要注意人工擦拭去除表面的微量殘留[8]。實際使用時還要注意根據所消毒物品的性質和空間大小（如實驗室房間、生物安全柜等）的不同，選擇適合的，不同規(guī)格、型號、能產生足量蒸汽的甲醛發(fā)生器。

[1] The State Council of People’s Republic of China. The regulation of biological safety of pathogenic micro-organism laboratory. 2004-11-12. (in Chinese)中華人民共和國國務院. 病原微生物實驗室生物安全管理條例.2004-11-12.

[2] China National Accreditation Committee for Laboratories. GB 19489-2008 Laborotories-general requirements for biosafety. Beijing:Standards Press of China, 2008. (in Chinese)中國實驗室國家認可委員會. GB 19489-2008 實驗室生物安全通用要求. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[3] World Health Organization. Laboratory biosafety manual. 3rd ed.Geneva: World Health Organization, 2004. (in Chinese)世界衛(wèi)生組織. 實驗室生物安全手冊. 3版. 日內瓦: 世界衛(wèi)生組織, 2004.

[4] Bi JJ, Wang Z, Chen JJ, et al. Safe disposal of wastes from high-level biosafety laboratories. Bull Acad Mil Med Sci, 2006, 30(4):394-397.(in Chinese)畢建軍, 王壯, 陳潔君, 等. 高級別生物安全實驗室廢棄物安全處置. 軍事醫(yī)學科學院院刊, 2006, 30(4):394-397.

[5] Wang QD. Management of the laboratory biosafty of our country.Chin Med Biotechnol, 2007, 2(1):6-8. (in Chinese)王秋娣. 我國實驗室生物安全管理. 中國醫(yī)藥生物技術, 2007, 2(1):6-8.

[6] Li MJ, Yuan Z, Liu J, et al. Influencing factors of ultraviolet ray disinfection in the laboratory for cell culture and its countermeasures.Lett Biotechnol, 2010, 21(3):453-454. (in Chinese)李盟軍, 袁征, 劉劍, 等. 影響細胞培養(yǎng)實驗室紫外線消毒效果的因素及對策. 生物技術通訊, 2010, 21(3):453-454.

[7] Han YQ, Liu YJ. Study on the action of the multiple factors influencing disinfection efficacy of formaldehyde fumigation.Disinfection Sterilization, 1989, 6(3):132-138. (in Chinese)韓友圻, 劉育京. 甲醛熏蒸消毒多因素影響作用的研究. 消毒與滅菌, 1989, 6(3):132-138.

[8] Xia DS, Chen HJ. Study on disinfection residual effect verification and validation method of formaldehyde. Shanxi Med J, 2011,40(7):720-721. (in Chinese)夏德生, 陳慧嬌. 甲醛消毒效果驗證及殘留驗證方法研究. 山西醫(yī)藥雜志, 2011, 40(7):720-721.

[9] Wang QS, Zhou ZM, Gao Y. Practical handbook of medical media.Beijing: People’s Military Medical Press, 1999. (in Chinese)王欽升, 周正明, 高屹. 實用醫(yī)學培養(yǎng)基手冊. 北京: 人民軍醫(yī)出版社, 1999.

[10] Wu HH, Ye ML, Li XD. Screening of random primer and optiming of reaction system for arbitrarily primed polymerase chain reaction on 8 sorts of bacteria. Chin J Nosocomiol, 2003, 13(12):1104-1106. (in Chinese)吳海寰, 葉明亮, 李曉娣. 細菌隨機引物聚合酶鏈反應分析中隨機引物的篩選與反應體系的優(yōu)化. 中華醫(yī)院感染學雜志, 2003, 13(12):1104-1106.