徐國強 倪海東 楊 明 蘇 波

(浦東出入境檢驗檢疫局 上海 200135)

1 前言

近年來，隨著食品生產(chǎn)工業(yè)化程度的提高，轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展和轉(zhuǎn)基因食品的普及，食物過敏性疾病發(fā)病率呈不斷增長的趨勢，已成為危害民眾特別是兒童身心健康的一種常見慢性疾病，嚴重者甚至會危及生命。世界衛(wèi)生組織(WHO)將食物過敏列為影響人們健康的第六大問題，對食物過敏原的研究亦已成為全球關注的公共問題之一。目前，食物過敏問題尚未引起我國政府及學者的足夠重視，國內(nèi)對食物過敏原的研究和關注與國外發(fā)達國家相比還有著較大差距，因此，食物過敏原已成為影響我國民眾健康的潛在性危險因素。全面了解食物過敏原的三維結構、生物活性和穩(wěn)定性等特點將有助于科學評估食物過敏反應風險，改善飲食習慣。

2 食物過敏原的確定

在過去的數(shù)十年，已有上百種植物源性和動物源性食物過敏原的結構特點得到確認，主要存在于少數(shù)蛋白質(zhì)家族。R D Finn等運用后基因組序列生物信息學分析方法，對Pfam數(shù)據(jù)庫已確定的11192個蛋白質(zhì)家族和植物源性食物過敏原進行了序列分析比較，結果顯示臨床已知的927個植物源性食物過敏原屬于27個蛋白質(zhì)家族［1］，其中65%歸屬在醇溶蛋白超家族、Cupin超家族、Bet v 1家族和profilins家族中。動物源性食物過敏原主要集中于原肌球蛋白家族、鈣離子結合蛋白家族和酪蛋白家族這3個蛋白質(zhì)家族中［2］。因此，與生物界存在的大量各種各樣蛋白質(zhì)相比，食物過敏原蛋白質(zhì)僅占很小一部分，說明蛋白質(zhì)保守的結構和生物活性決定蛋白質(zhì)過敏的特點。雖然目前對產(chǎn)生過敏反應的分子基礎尚不清楚，但從現(xiàn)有研究結果看，蛋白質(zhì)的過敏性取決于多方面的因素，包括蛋白質(zhì)的家族屬性、三維結構、生物活性和對消化的穩(wěn)定性。

3 植物源性食物過敏原蛋白質(zhì)家族

3.1 Cupin 超家族(Cupin Superfamily)

Cupin來源于拉丁語“cupa”，是一個具有多種功能蛋白的家族，廣泛分布于真菌、高等植物和動物，結構上有至少6個β－折疊形成的桶狀結構［3］;其三級結構具有耐熱性，可以儲存氨基酸;根據(jù)蛋白質(zhì)中含有Cupin結構域的數(shù)目又將它們分成不同的Cupin亞群［4］。具有2個Cupin結構域的蛋白質(zhì)最初在高等植物種子儲藏蛋白中被發(fā)現(xiàn)，分為7S球蛋白三聚體(豌豆球蛋白)和11S球蛋白六聚體(豆球蛋白)，這兩類蛋白質(zhì)代表雙子葉植物種子的主要成分，對人類具有營養(yǎng)價值，是其重要的蛋白質(zhì)來源。7S和11S球蛋白大約只有35% －45%的序列相同，但在結構上卻具有高度的相似性［5］。7S球蛋白三聚體分子量約150－190KD，花生過敏原Ara h1、核桃過敏原Jur r 2、芝麻過敏原Ses i s均屬于該蛋白質(zhì);屬于11S球蛋白的有花生過敏原Ara h 3、巴西堅果Ber e 2、蕎麥過敏原Fag e 1［6］。近來研究發(fā)現(xiàn)，在紅豆中存在5種過敏原，Caj c 1、Caj c 2、Caj c 3、Caj c 4、Caj c 5均屬Cupin超家族。Caj c 1與紅豆β球蛋白的α鏈在結構上具有很高的同源性，而Caj c 2、Caj c 3、Caj c 4、Caj c 5 與黃豆 β 球蛋白的α亞基在結構上有顯著的序列相似性。因此，紅豆與綠豆、黃豆、鷹嘴豆存在交叉過敏反應［7］。綠豆中已確定的3種過敏蛋白質(zhì)分別為VIG R 2、VIG R 3、VIG R 4，它們與扁豆、豌豆等中的已知過敏原表現(xiàn)出顯著的序列相似性［8］。

3.2 醇溶蛋白超家族(Prolamin Superfamily)

醇溶蛋白超家族包括4種植物源性食物過敏原蛋白，分別是谷物的種子貯藏醇溶蛋白、非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白、α－淀粉酶蛋白酶抑制劑和2S清蛋白。這個家庭成員的特點是存在8個半胱氨酸殘基保守骨架，三維結構擁有由二硫鍵連接4個α－螺旋組成的一個相對折疊區(qū)域，對熱加工和蛋白水解穩(wěn)定;具有相同三維結構的不同蛋白，其氨基酸序列相似性較低。

3.2.1 種子貯藏醇溶蛋白(Prolamin seed storage proteins)

谷物，特別是小麥都有引起職業(yè)過敏的文獻記載，例如面包師的哮喘和腹腔疾病。盡管人們普遍認為谷物是重要的致過敏食物，而且50%的谷物蛋白是醇溶蛋白，但是它們誘發(fā)IgE介導過敏反應的文獻報告很少，到目前為止，只有小麥誘發(fā)過敏性皮炎的報道［9］，其中醇溶蛋白和麥谷蛋白等被認為是主要過敏原［10］。

3.2.2 非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(non－special lipid transfer proteins，nsLTPs)

nsLTPs是一類小分子可溶性蛋白，在高等植物中占全部可溶性蛋白的4%［11］，是存在于薔薇科水果中的主要食物過敏原，如桃(Pru p 3)、蘋果(Mal d 3)、杏(Pru ar 3)和(Pru d 3)等［12］，也廣泛存在于其他植物源性食物中，如蔬菜、谷物、堅果，且這些過敏原同源性較高。根據(jù)分子量大小，植物nsLTPs可分為2大類，nsLTP1和 nsLTP2，分子量分別為9kDa和7kDa，它們的作用是在細胞膜間促進磷脂運輸。nsLTPs具有良好的穩(wěn)定性，在4℃可貯存數(shù)月之久，在100℃ 高溫下結構不發(fā)生變化，對酶消化具有很高的穩(wěn)定性，經(jīng)過胃腸道消化后仍然保留其免疫原性和致敏性。其結構特點是有4個α－螺旋的緊湊結構，內(nèi)部通過4個二硫鍵對空間結構進行穩(wěn)定。對nsLTPs過敏的患者往往是通過特異性的IgE介導過敏反應，產(chǎn)生嚴重的過敏癥狀。因此，nsLTPs－特異性IgE被視為一個危險因素，目前正在探索把它作為過敏反應的診斷標志物。近來，Masako Toda等通過對桃nsLTP的Pru p 3的研究，發(fā)現(xiàn)破壞Pru p 3蛋白的結構能顯著降低消化的穩(wěn)定性、抗原性和致敏性，并認為結構上展開的Pru p 3具有低致敏性，可能作為桃過敏患者治療的候選疫苗［13］。

3.2.3 α －淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑(α －Amylase/trypsin inhibitors)

α－淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑主要存在于谷物，可通過呼吸道引起人體過敏，從而引發(fā)職業(yè)性過敏如面包師哮喘(小麥、大麥和黑麥);或通過胃腸道引起食物過敏(小麥、大麥和大米)。米粒中最主要的過敏原是α－淀粉酶抑制蛋白［14］，玉米和啤酒(來源大麥)的過敏原也是屬于α－淀粉酶抑制蛋白家族［15，16］，分子量約 16 kDa。胰蛋白酶抑制劑廣泛存在于豆類、谷物中，主要分布于這些作物的種子中，特別在大豆和綠豆中含量豐富。

3.2.4 2S清蛋白(2S－albumins)

2S清蛋白存在于許多單、雙子葉植物物種中，對植物抵御真菌的攻擊有一定的保護作用。近年來，這個蛋白家族的一些成員被認為是主要的食物過敏原，具有與過敏患者血清中IgE高度結合的能力［17］，例如黃芥末 Sin a 1、巴西和英國核桃 Ber e 1、Jug r 1、花生 Ara h 2 和 Ara h 6。

3.3 Bet v 1同源蛋白(Bet v 1 homologous proteins)

Bet v 1同源蛋白家族遍布整個植物王國，大小約為154－160個氨基酸殘基的多肽，由8個亞家族構成［18］，擁有很高的序列相似性，包括疾病相關蛋白家族10(PR－10)、乳膠蛋白和參與生物堿合成的蛋白質(zhì)。樺樹花粉過敏原Bet v 1是這個家族的代表性成員，90%樺樹花粉過敏的患者都是由它引起過敏癥狀［19］。在一般情況下，這些蛋白質(zhì)編碼基因形成了一個多基因家族，例如蘋果PR－10，至少有18種不同的基因?qū)al d 1編碼，其位置位于染色體的不同區(qū)域［20］。對櫻桃 Bet v 1、Pru av 1、芹菜Api g 1和蘿卜Dau c 1進行X －射線結構分析，顯示它們都有一個共同特點，即整體折疊形成七股反平行β－折疊［21，22］。Bet v 1同源蛋白在樺樹花粉、成熟水果(蘋果、梨、櫻桃和薔薇科的其他成員)、植物根莖(胡蘿卜等)、植物鱗莖及芹菜等中均有表達。此外，遭受病原體攻擊后或在逆境中生長的植物，Bet v 1同源蛋白的表達可能增加。Bet v 1同源蛋白同時還是潛在的吸入性過敏原，最初對花粉過敏的患者中多數(shù)往往發(fā)展成對水果(蘋果、梨、櫻桃、獼猴桃、菠蘿蜜)、堅果(榛子)和蔬菜(胡蘿卜、芹菜、香菜)中的 Bet v 1同源蛋白產(chǎn)生過敏反應［23］，但產(chǎn)生的過敏癥狀通常比較溫和，限于口腔，概括為口腔過敏綜合征。Bet v 1同源蛋白(即使較遠相關的植物物種)序列具有較高同源性，空間上有著相似的三維結構，這可以解釋為什么IgE介導的交叉過敏反應與相關花粉食物過敏綜合征臨床癥狀一致。在一般情況下，Bet v 1同源蛋白對pH值的變化具有不穩(wěn)定性，對熱處理有抵抗作用，因此水果和蔬菜的Bet v 1相關蛋白在大多數(shù)情況下僅引起輕微的局部癥狀。

3.4 抑制蛋白(Profilins)

抑制蛋白存在于所有真核細胞中，是細胞溶質(zhì)蛋白。作為肌動蛋白的結合蛋白［24］，在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的運輸、細胞形態(tài)和分裂過程中可能會起到關鍵作用。抑制蛋白的編碼基因形成了一個基因家族［25］，因此植物抑制蛋白的序列同源性很高，超過75%序列相似，并且其序列長度也很保守，大約14 KDa。大量的抑制蛋白基因在不同的植物，如小麥、菜豆、西紅柿、牧草中被克隆，其免疫學特性也有研究。1991年，樺樹的次要過敏原Bet v 2被鑒定為抑制蛋白，從而引起了過敏研究者對它的關注。作為過敏原的抑制蛋白主要存在于植物花粉、水果和蔬菜中，如梨Pyr c 4、櫻桃Pru av 4、桃Pru p 4等。一般估計10%－20%的樺樹花粉過敏患者顯示抑制蛋白過敏癥狀，因此抑制蛋白過敏被視為與花粉相關的食物過敏的一個潛在的風險。Asero等［26］通過研究一組對水果和蔬菜過敏的患者，發(fā)現(xiàn)抑制蛋白致敏和甜瓜、柑橘類水果、香蕉和番茄引起的臨床過敏之間存在關聯(lián)，不同植物間這種抑制蛋白序列和結構上的相似性易產(chǎn)生IgE介導的過敏交叉反應。體外實驗對芹菜抑制蛋白的Mal d 4和Cuc m 2進行加熱、放射和超高壓處理，IgE的結合活性并沒有受到影響;然而，當pH值降低或在胃液中消化，抑制蛋白很容易降解，不顯示進一步的過敏性活動［27，28］。水果中抑制蛋白較難純化，僅有少數(shù)重組蛋白報道。

3.5 其他植物源性食物過敏原家族

其他植物源性過敏原屬于分布較少的過敏原家族。Oleosins被認為是有助于穩(wěn)定植物存儲結構的蛋白質(zhì)組成部分，近年來確定對豆類、堅果和種子［29－31］的過敏來自Oleosins。植物遭受病原體侵染時，發(fā)病過程中相關蛋白的數(shù)量會增加。令人驚奇的是，相當數(shù)量的食物過敏原來源于各種與發(fā)病機制相關的蛋白家族，如各類幾丁質(zhì)酶、β－1，3－葡聚糖酶和類甜蛋白［32］。幾丁質(zhì)酶的活性是由220－230個氨基酸殘基形成的催化結構域所決定［33］，主要分布于巴西橡膠乳、鱷梨Pers a 1、板栗Cas s5、葡萄Vit v 5［34］。另一類植物防御蛋白是由β－1，3葡聚糖酶組成，這類糖基水解酶有一個(αβ)8桶狀結構，大小在25－35 kDa，主要作用是催化水解β－1，3－葡聚糖中的1，3－β－D－葡萄糖苷鍵，因此被認為是在預防植物病原微生物中發(fā)揮作用。但它們也作用于未受感染植物的生理和發(fā)育過程，如花粉形成和花粉管生長，營養(yǎng)、果實成熟，種子萌發(fā)。此外，它們還對損傷、寒冷、臭氧和紫外線的輻射產(chǎn)生反應。這個蛋白家族的過敏原存在于鱷梨、香蕉、栗子、無花果、獼猴桃［35］以及吸入性過敏原橄欖花粉［36］和乳膠［37］中。類甜蛋白是一類在惡劣條件下大量積累的抗真菌蛋白，可以增強植物抵抗冰凍和干旱逆境的能力，但全部功能尚不清楚。類甜蛋白分子量約20kDa，結構上形成反平行β－折疊，通過8個二硫鍵使結構穩(wěn)定［38］。由于二硫鍵形成的剛性結構，他們能經(jīng)受耐熱處理和蛋白降解［39］。病程相關蛋白家族的過敏原已發(fā)現(xiàn)在多種水果中存在，如櫻桃(Pru av 2)、蘋果(Mal d 2)、獼猴桃(Act d 2－綠色獼猴桃，Act c 2－金奇異果)、橙、葡萄、柿子椒(Cup a 1)［39］。

4 動物源性食物過敏原蛋白質(zhì)家族

4.1 原肌球蛋白(Tropomyosin)

原肌球蛋白存在所有真核細胞，是高度保守的α－螺旋蛋白。它們由2套7個肌動蛋白結合位點形成兩個平行的雙螺旋結構，在橫紋肌細胞中促進肌鈣蛋白和肌動蛋白之間的相互作用從而調(diào)節(jié)肌肉收縮［40］。原肌球蛋白食物過敏原主要分布在甲殼動物、軟體動物和魚類寄生蟲及吸入性過敏原螨蟲［41］。到目前為止，只有非脊椎動物原肌球蛋白才產(chǎn)生過敏性反應，同時具有高度交叉反應。以原肌球蛋白為代表的主要食物過敏原，在多數(shù)情況下只是引起輕微的吸入性過敏反應，由于它們的結構特點，即使在加熱處理或酶消化后仍然保留他們同IgE的結合能力，即有一定的穩(wěn)定性。

4.2 鈣離子結合蛋白(calcium－binding proteins)

鈣離子結合蛋白典型的結構特征是擁有EF－h(huán)and結構域，即由12個氨基酸殘基組成的鈣離子結合環(huán)和兩個相鄰α－螺旋的12個氨基酸構成一個保守結構域，參與細胞間信號傳導或運輸。在脊椎動物中，該蛋白與Ca2+結合，使得肌肉放松，因而大量在肌肉組織中表達。鈣離子結合蛋白的代表性過敏原是小清蛋白，分子量約12kDa，是 Elsayed等［42］在1971年從鱈魚中發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于各種魚類中［43，44］。鯉魚和鱈魚的小清蛋白是典型的α－螺旋結構蛋白質(zhì)，即使被加熱到95℃，仍能保持蛋白的穩(wěn)定性，然而在酸性條件下小清蛋白很不穩(wěn)定，因此，主要魚類過敏原的過敏活性可以被胃酶所降解。但是，在生理性消化條件受損的情況下，這些過敏原可以保存下來，從而增加過敏的風險［45］。雖然小清蛋白是魚類食物的主要過敏原，且和來源于兩棲動物的小清蛋白發(fā)生交叉反應，但是迄今沒有發(fā)現(xiàn)高等脊椎動物的小清蛋白能夠引起過敏現(xiàn)象。

4.3 酪蛋白(Caseins)

酪蛋白結構上顯示一個隨機螺旋結構，它廣泛存在哺乳動物的乳液中，αs1－酪蛋白和αs2酪蛋白是最重要的過敏原，其次是β－酪蛋白。有文獻報道，牛奶的酪蛋白和山羊、綿羊酪蛋白存在IgE之間的交叉反應，而馬奶酪蛋白的 IgE交叉反應較低［46］。牛奶中的酪蛋白主要由αs1－酪蛋白、β－酪蛋白以及少量αs2－酪蛋白和κ－酪蛋白組成，相比之下，羊奶的酪蛋白主要由β－酪蛋白組成，同時含有少量αs1－酪蛋白、κ－酪蛋白和αs2－酪蛋白。

4.4 其他動物源性食物過敏原家族

其他動物源性食物過敏原家族分布不廣泛，例如牛奶過敏原β－乳球蛋白(Bos d 5)屬于載脂蛋白家族。作為小分子的載體，這類蛋白質(zhì)家族的成員共享一個保守的三維結構，但整體序列相似性較低。除了來源于牛奶的食物過敏原，還有動物皮屑和哺乳類動物的唾液以及昆蟲和蟑螂吸入性過敏原等［47］。α－乳清蛋白(Bos d 4)屬于 C－型溶菌酶/α－乳清蛋白家族，它能夠結合鈣，參與牛奶中的乳糖合成。其他過敏原家族包括Kazal型蛋白酶抑制劑，來源于蛋清的卵類粘蛋白(Gal d 1)，是該類蛋白家族代表性的過敏原［48］;另一類蛋白酶抑制劑家族是絲氨酸蛋白酶抑制劑，代表性的過敏原是卵清蛋白Gal d 2。近年來，轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵硫蛋白已被確定為牛奶中的過敏原;卵轉(zhuǎn)鐵蛋白Gal d 3、C型溶菌酶(Gal d 4)、α－卵黃蛋白(Gal d 5)是禽蛋類中的過敏原［49］。

5 結論

食物過敏原只限于小部分蛋白質(zhì)家族，這些蛋白質(zhì)具有某些生物學功能，如蛋白質(zhì)水解、結合、運輸、配體儲存等。在一般情況下，與蛋白質(zhì)過敏原空間結構相似的蛋白質(zhì)具有引起過敏癥狀的風險。蛋白質(zhì)表面暴露的特異性區(qū)域能夠使過敏個體中產(chǎn)生特異性IgE抗體，同時，個別氨基酸殘基對于抗體識別非常關鍵，這些氨基酸殘基變化可以顯著影響IgE結合活性。

影響致敏性的其他因素是不同的食物基質(zhì)和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。近年來，許多學者通過基因工程技術能有效減少或消除蛋白過敏原的過敏活性，并在黃豆、花生、西紅柿、蘋果等植物蛋白過敏原中獲得成功。因此，調(diào)節(jié)食物蛋白過敏活性是未來的一個研究方向，而在體外使用已確定的高純度過敏原是研究蛋白過敏活性的先決條件。采集過敏原家族的性能數(shù)據(jù)，建立食物過敏原數(shù)據(jù)庫，包括重要的食物過敏原分布范圍、過敏原生物活性特點、空間結構、氨基酸序列等，將有助于食品生產(chǎn)企業(yè)的食品加工處理策略，控制或降低過敏原暴露的風險，同時給食物過敏患者的飲食提供合理建議以及提高食物過敏原的診斷。

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