王 晶，洪 鐵，張英鴿

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所納米藥理毒理重點實驗室，北京 100850;2.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，吉林長春 130021)

納米粒子是指尺度在1～100 nm之間的微粒[1]，這類粒子具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等納米特性。應(yīng)用納米粒子的某些特殊性質(zhì)，將其應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，可作為疫苗佐劑以增強抗原免疫原性及作為藥物載體提高藥物治療的靶向性。納米粒子具有淋巴靶向性[2]，易在淋巴系統(tǒng)分布和存留。淋巴系統(tǒng)作為機體的免疫系統(tǒng)，對于機體抵御外來侵害具有重要作用。因此，研究納米粒子對免疫系統(tǒng)的影響具有重要意義。

1 對固有免疫系統(tǒng)的影響

固有免疫系統(tǒng)又稱非特異性免疫系統(tǒng)，是免疫防御的第一道防線。納米粒子通過以下方式對固有免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響:①影響免疫細胞的活性;②非特異性地增強或減弱免疫反應(yīng)，參與免疫調(diào)節(jié);③激活補體系統(tǒng)。

納米粒子能夠影響固有免疫細胞的活性及免疫系統(tǒng)免疫分子的分泌。Morimoto等[3]在對呋侖碳納米粒子的研究中發(fā)現(xiàn)，在大鼠氣管內(nèi)滴注呋侖碳1 mg能夠?qū)е轮行粤＜毎爸行粤＜毎吇蜃?(neutrophil chemotactic factor-1，NCF-1)，NCF-2αβ和NCF-3出現(xiàn)短暫的顯著增加。Simeonova等[4]發(fā)現(xiàn)，結(jié)合了表柔比星(表阿霉素，epirubicin)的聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒子能抑制自然殺傷細胞(NK)的活性，而不結(jié)合表柔比星或與表柔比星簡單混合的對照樣品則會增強NK細胞的活性。此外，Jovanovic等[5]用黑頭呆魚研究納米尺寸的TiO2(＜100 nm)對中性粒細胞功能和免疫基因表達的影響，通過考察突發(fā)性氧化作用、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白(norepinephrine transporter，NET)釋放和原發(fā)顆粒(primary granule)脫顆粒研究TiO2納米粒子對中性粒細胞的作用，通過實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)對固有免疫系統(tǒng)相關(guān)調(diào)控基因的表達進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TiO2納米粒子0.1 mg·L-1在體外能夠刺激產(chǎn)生突發(fā)性氧化作用和NET釋放，腹膜內(nèi)注射TiO2納米粒子10 mg·kg-1引起突發(fā)性氧化作用、NET釋放和脫顆粒顯著下降。黑頭呆魚暴露在TiO2納米粒子中 48 h，體內(nèi)白細胞介素 11(interleukin-11，IL-11)、巨噬細胞刺激因子1和中性粒細胞胞漿因子2表達水平顯著升高，從而表明TiO2納米粒子具有干擾固有免疫系統(tǒng)免疫應(yīng)答的潛能，引起IL-11、巨噬細胞刺激因子1和中性粒細胞胞漿因子2的基因水平上調(diào)。

巨噬細胞是機體的監(jiān)視細胞，能夠監(jiān)視進入機體的外來物質(zhì)[6-7]，并在清除抗原和調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)方面起著重要的作用[8]。體外實驗結(jié)果表明，納米粒子能夠進入巨噬細胞[9]，并引起氧化應(yīng)激和線粒體損傷[10]。一些體內(nèi)研究亦表明，大鼠吸入Fe2O3納米粒子92 mg·m-3，每天6 h，連續(xù)3 d，出現(xiàn)較弱的呼吸道反應(yīng)[11]。Wesselius等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2O3納米粒子引起的細胞毒性是由于細胞內(nèi)的氧化效應(yīng)。此外，Wang等[13]認(rèn)為，F(xiàn)e2O3納米粒子能夠引起細胞內(nèi)氧自由基的增加，從而導(dǎo)致小鼠巨噬細胞細胞膜通透性增加，抑制鈉-鉀ATP酶和鈣-鎂ATP酶活性，損傷膜功能，導(dǎo)致巨噬細胞的腫脹、變性和壞死，而巨噬細胞的功能性損傷將會影響到機體免疫系統(tǒng)的平衡。Kim等[14]對多吡咯納米粒子引起的細胞毒性和其對免疫系統(tǒng)的影響進行了研究，結(jié)果表明，用多吡咯納米粒子20，40，60，80和100 nm分別以不同的濃度10，25，100，250和500 g·L-1作用于人肺成纖維細胞IMR90和大鼠肺泡巨噬細胞J774A.1細胞24 h，其對細胞存活、氧化應(yīng)激、細胞凋亡率和壞死率的影響均具有尺寸和濃度依賴關(guān)系，即隨著尺寸的減小或濃度的增大，其毒性增大。通過測定巨噬細胞表面協(xié)同刺激分子的表達來分析多吡咯納米粒子引起的免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)與輔助性T細胞1(T helper cells 1，Th1)應(yīng)答相關(guān)的協(xié)同刺激分子CD40和CD80的表達上調(diào)(P＜0.05)，與Th2細胞應(yīng)答相關(guān)的協(xié)同刺激分子CD86的表達下降(P＜0.05)。納米粒子在藥物遞送系統(tǒng)的應(yīng)用中，用聚乙二醇進行表面修飾可以延長納米粒子在血液中的循環(huán)，并特異性地降低脾和肝固有吞噬細胞對其的攝取[15]。

NK T細胞是T細胞的一個亞群，與樹突狀細胞(dendritic cell，DC)和巨噬細胞共同參與早期免疫應(yīng)答產(chǎn)生的細胞因子種類及水平的平衡調(diào)節(jié)，決定所產(chǎn)生的免疫類型。但NK T細胞易被誘導(dǎo)無反應(yīng)性。Thapa等[16]將α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-galactosylceramide，α-Gal)結(jié)合到聚乳酸納米粒子上，制備成α-Gal納米粒子，在體內(nèi)外檢測其對NK T細胞的刺激作用。結(jié)果顯示，與可溶性的α-Gal相比，α-Gal納米粒子能夠持續(xù)刺激NK T細胞活化而不會誘導(dǎo)NK T細胞無反應(yīng)性，這就解決了α-Gal存在的誘導(dǎo)NK T細胞無反應(yīng)性這一問題。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，納米粒子表面電荷的修飾或配體的修飾能夠加強免疫器官中DC對納米粒子的攝取和吸收。

補體系統(tǒng)是體內(nèi)重要的免疫效應(yīng)系統(tǒng)和效應(yīng)放大系統(tǒng)，參與機體的抗感染及免疫調(diào)節(jié)，也可介導(dǎo)病理性反應(yīng)。在正常生理情況下，絕大多數(shù)補體固有分子均以酶原或非活化形式存在于血清中，在某些啟動因素作用下，補體分子按一定順序以連鎖反應(yīng)的方式依次活化，形成一系列放大的級聯(lián)效應(yīng)，最終導(dǎo)致一系列生物學(xué)效應(yīng)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。Salvador-Morales等[17]采用新鮮的人血清通過溶血實驗、Western印跡和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳證明了碳納米管可以通過經(jīng)典途徑和旁路途徑活化補體系統(tǒng)，其機制可能是碳納米管直接與C1q(經(jīng)典途徑)和C3b(旁路途徑)結(jié)合或C1q和C3b通過與血漿或血清蛋白結(jié)合后然后吸附到碳納米管上，從而激活補體系統(tǒng)并導(dǎo)致炎性肽C3a，C4a和C5a的產(chǎn)生;他們同時觀察了碳納米管對補體和血漿蛋白的作用，結(jié)果表明，碳納米管可以增強抗原的免疫原性，因此碳納米管可作為免疫佐劑增強機體的免疫應(yīng)答。但同時碳納米管也會引起炎癥反應(yīng)和肉芽腫的形成，激發(fā)補體過度活化而造成免疫損傷，從而介導(dǎo)病理性過程。

在非特異性病原體清除過程中，納米粒子起著重要的作用。納米粒子能夠誘導(dǎo)補體的活化，從而加強B細胞介導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答，并促進DC和T細胞的活化[18]。

2 對特異性免疫系統(tǒng)的影響

2.1 對抗原遞呈細胞的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，納米粒子是免疫應(yīng)答的活化劑，能夠影響免疫細胞的活性，促進免疫應(yīng)答的發(fā)生。在特異性免疫應(yīng)答中，抗原遞呈具有重要作用，抗原遞呈細胞對抗原的識別與遞呈是機體免疫反應(yīng)的首要環(huán)節(jié)。

DC是目前所知的機體內(nèi)功能最強的專職性抗原遞呈細胞，是機體免疫反應(yīng)的始動者。DC在宿主免疫防御方面起著重要的作用，如清除外來病原體、抑制腫瘤發(fā)生等。有研究結(jié)果顯示，納米粒子能夠促進DC細胞的成熟和對抗原的遞呈。Akagi等[19]將滅活的HIV病毒抗原包裹在疏水性多聚谷氨酸衍生物納米粒子中，這種載有HIV病毒抗原的納米粒子能被未成熟的DC捕獲，進而誘導(dǎo)這些未成熟的DC成熟，從而發(fā)揮抗原遞呈作用。他們發(fā)現(xiàn)，這種裝載了HIV病毒的納米粒子可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性細胞毒反應(yīng)。Yang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，[Gd@C82(OH)22]n納米粒子是 DC 和 Th1細胞免疫應(yīng)答的有效的活化劑，它們從以下三方面促進DC表型的成熟:① 刺激DC產(chǎn)生IL-12 p70等細胞因子;② 使DC協(xié)同刺激分子CD80，CD83和CD86和主要組織相容性復(fù)合體 (人類白細胞抗原-A，-B，-C和-DR)分子的表達上調(diào);③使DC從CCL5敏感型向CCL19敏感表型轉(zhuǎn)化。他們還發(fā)現(xiàn)，此類納米粒子是Th1細胞免疫應(yīng)答的活化劑，能使卵白蛋白(ovalbumin，OVA)特異性Th1細胞免疫應(yīng)答水平加強。納米粒子表面用殼聚糖和甘露糖修飾使其功能化，通過特異的吞噬途徑能將納米粒子傳遞給巨噬細胞和DC，因而增強納米粒子所連接抗原的免疫應(yīng)答[21-23]。

但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，一些納米粒子會使DC的功能下降。例如，Blank等[24]發(fā)現(xiàn)，用聚乙烯醇包衣的表面順磁的氧化鐵納米粒子能使人單核細胞演變的DC加工抗原，刺激CD4+T淋巴細胞增殖，誘導(dǎo)生成細胞因子的能力下降。

2.2 對T淋巴細胞的影響

CD8+T細胞主要為細胞毒T淋巴細胞亞群，主要通過特異性細胞毒效應(yīng)和分泌釋放γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α )和TNF-β 等細胞因子介導(dǎo)特異性免疫效應(yīng)，參與細胞免疫應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)。CD8+T細胞對靶細胞的殺傷作用具有抗原特異性。Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，將 HIV-1外膜蛋白 gp120結(jié)合到多聚 γ-谷氨酸〔poly(γ-glutamic acid)，γ-PGA〕納米粒子上能夠誘導(dǎo)更為強烈的細胞免疫應(yīng)答，促進長時效的記憶性CD8+T淋巴細胞的形成。γ-PGA納米粒子是極好的疫苗載體，它能傳遞抗原給抗原遞呈細胞，并激活抗原特異性細胞毒T淋巴細胞的免疫應(yīng)答[26-28]。Yoshikawa等[26]發(fā)現(xiàn)，小鼠皮下免疫 γ-PGA納米粒子包裹的OVA與弗氏完全佐劑乳化的OVA比較，能更加高效地抑制OVA轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞的生長。而且，γ-PGA納米粒子不會引起皮下接種組織病理學(xué)的改變且靜脈注射也不會引起嚴(yán)重毒性。Chen等[29]發(fā)現(xiàn)，靜脈注射Fe3O4磁性納米粒子能夠以劑量依賴的方式影響正常ICR小鼠的免疫功能。低劑量(5.14 mg·kg-1)組Fe3O4納米粒子淋巴細胞增殖率高于對照組，而溶媒組(生理鹽水)和高劑量(51.4 mg·kg-1)組的淋巴細胞增殖與對照組相比卻較低。在外周血中，低劑量(5.14 mg·kg-1)組的CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的比例要高于對照組。Fe3O4納米粒子還能夠促進IL-2，IFN-γ和IL-10的分泌。此外，Thapa等[16]研究發(fā)現(xiàn)，納米粒子可被α-Gal和蛋白/肽抗原同時包被，作為獨特的疫苗佐劑。將OVA和gp100的黑色素瘤抗原肽共軛結(jié)合到α-Gal包裹的納米粒子上，能夠誘導(dǎo)有效的抗原特異性CD8+T細胞免疫應(yīng)答。Stano等[30]將OVA共軛結(jié)合到聚丙烯硫化物納米粒子上，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)肺組織和脾組織的細胞毒T淋巴細胞的免疫應(yīng)答;此外，將Toll樣受體的配體鞭毛蛋白作為免疫刺激佐劑共軛結(jié)合到聚丙烯硫化物納米粒子上，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)以Th1細胞為主的細胞免疫應(yīng)答。

2.3 對B淋巴細胞的影響

B淋巴細胞是機體體液免疫的主要細胞。Inoue等[31]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)燃機車排氣中富含的納米粒子能以劑量依賴的方式顯著增加脾細胞表面CD11C，CD80和CD86這些促進DC成熟、活化及CD69和CD40L這些促進T細胞活化的分子的表達。

Nygaard等[32]研究發(fā)現(xiàn)，單壁納米碳管(single-walled carbon nanotubes，swCNT)和多壁納米碳管(multi-walled carbon nanotubes，mwCNT)可增強小鼠的過敏反應(yīng)。他們采用變應(yīng)原OVA致敏，將BALB/c小鼠暴露在swCNT，mwCNT和超細炭黑粒子(ultrafine carbon black particles，ufCSP)中，檢測血清中針對OVA的特異性抗體IgE，IgG1，IgG2α和支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞的數(shù)量及細胞因子水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，swCNT和mwCNT與OVA同時作用于小鼠，血清中OVA特異性抗體IgE水平升高，支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞數(shù)量增加，縱隔淋巴結(jié)中與Th2細胞相關(guān)的細胞因子的分泌增強。而mwCNT和ufCSP分別與OVA作用于小鼠，支氣管肺泡灌洗液中IgG2α、中性粒細胞、TNF-α和單核細胞趨化蛋白1的水平增加。

Stano等[30]將OVA共軛結(jié)合到聚丙烯硫化物納米粒子上，其可誘導(dǎo)黏膜的體液免疫應(yīng)答;此外，還發(fā)現(xiàn)將Toll樣受體的配體鞭毛蛋白作為免疫刺激佐劑共軛結(jié)合到聚丙烯硫化物納米粒子上可使氣道、陰道和直腸黏膜的體液免疫應(yīng)答增強。Gou 等[33]對聚 ε-己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚 ε-己內(nèi)酯〔poly(ε-caprolactone)-poly(ethylene glycol)-poly(ε-caprolactone)，PCEC〕納米粒子和陰性甘露聚糖修飾的PCEC(MPCEC)納米粒子進行了研究，通過靜電作用將人堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)吸附到陰性的納米粒子表面，然后將吸附bFGF的納米粒子皮下注射給小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bFGF-MPCEC復(fù)合體與bFGF-PCEC和bFGF+鋁鹽佐劑相比，自身抗體 IgG，IgG1和IgG2α水平升高。他們認(rèn)為，這是由于甘露聚糖功能化的MPCEC納米粒子能夠靶向DC，從而使體液免疫應(yīng)答增強導(dǎo)致的。

Sarti等[34]將OVA 和單磷酰脂質(zhì) A(monophosphoryl lipid A，MPLA)結(jié)合到聚乳酸聚乙醇酸共聚物納米粒子上，與OVA+PBS組相比發(fā)現(xiàn)，OVA特異的IgG免疫應(yīng)答顯著提高;此外，IgA抗體水平也顯著高于對照組。Huang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，將滅活的H5N1流感病毒和CpG(一種包含有未甲基化的胞嘧啶-鳥苷模體的免疫刺激的寡聚脫氧核苷酸)包裹進乳化的納米粒子中，也對體液免疫產(chǎn)生影響。

此外，有學(xué)者對納米紅色元素硒進行了研究。納米紅色元素硒是以蛋白質(zhì)為分散劑的一種納米粒子，粒徑為20～60 nm。Gao等[36]采用動物實驗研究納米紅色元素對免疫功能的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)納米紅色元素對小鼠免疫功能有明顯的調(diào)節(jié)作用，硒50.0 μg·kg-1組小鼠的細胞免疫功能、體液免疫功能和巨噬細胞吞噬功能明顯增強。

此外，一些納米粒子對免疫排斥反應(yīng)還具有抑制作用。例如，Chen等[37]研究發(fā)現(xiàn)，聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子在腹腔內(nèi)移植豬肝細胞治療大鼠急性肝衰竭過程中對體液免疫排斥反應(yīng)具有一定的抑制作用。

3 對炎癥反應(yīng)的影響

已有研究發(fā)現(xiàn)，納米粒子因其比表面積大，且能夠滲入呼吸道，因此可導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。Inoue等[38]研究了納米粒子的尺寸效應(yīng)對細菌內(nèi)毒素引起的肺炎的影響，發(fā)現(xiàn)碳黑納米粒子能夠增強與氣道炎癥反應(yīng)相關(guān)抗原的免疫原性。炭黑納米粒子可加劇與細菌內(nèi)毒素相關(guān)的肺炎。在整體水平上，14 nm納米粒子較56 nm納米粒子的作用更為明顯，14 nm粒子能顯著加重脂多糖誘發(fā)的肺炎和肺水腫，而且增加肺部IL-1β，巨噬細胞炎性蛋白1ɑ，巨噬細胞趨化蛋白1、巨噬細胞炎性蛋白2和角化細胞趨化因子的分泌，而56 nm粒子無明顯影響。Han等[39]研究也發(fā)現(xiàn)，對于OVA誘導(dǎo)的大鼠哮喘模型，氣管內(nèi)吸入納米SiO2能夠?qū)е職獾栏叻磻?yīng)性和氣道重構(gòu)。他們認(rèn)為這可能是納米SiO2促進組織分泌IL-4而導(dǎo)致Th1/Th2細胞產(chǎn)生細胞因子的不平衡造成的。

Li等[40]認(rèn)為微粒導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的機制之一是產(chǎn)生氧化應(yīng)激，微粒誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的細胞效應(yīng)包括氧化劑的活化、炎癥反應(yīng)和毒性反應(yīng)。微粒導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)的前期主要是細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生和黏附分子的表達。

導(dǎo)致炎癥反應(yīng)并不是納米粒子的特性。據(jù)報道，一些納米粒子還具有保護性治療作用。Park等[41]研究了銀納米粒子對支氣管炎和氣道高反應(yīng)性的影響，結(jié)果表明，銀納米粒子可能具有減弱抗原誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)和高反應(yīng)性的能力。他們采用OVA致敏的過敏性氣道反應(yīng)疾病的小鼠模型來評價銀納米粒子在過敏性氣道疾病的作用和相關(guān)分子機制。小鼠在吸入OVA后，炎癥細胞數(shù)量升高，氣道反應(yīng)性高，肺部的IL-4、IL-5、IL-13和 NF-κB 水平升高;而在給予銀納米粒子后，上述指標(biāo)均顯著降低。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，在吸入OVA后，肺泡支氣管灌洗液中升高的細胞內(nèi)活性氧水平在給予銀納米粒子后下降。這些發(fā)現(xiàn)可能揭示銀納米粒子保護和治療哮喘的可能的分子機制。此外，Liu等[42]發(fā)現(xiàn)，聚乳酸聚乙醇酸共聚物-蒿屬花粉納米疫苗免疫治療小鼠哮喘有良好療效，其機制可能與調(diào)節(jié)Thl/Th2細胞平衡有關(guān)。Yudoh等[43]研究發(fā)現(xiàn)，水溶性的C60(碳60)可以作為抑制關(guān)節(jié)炎的抗氧化治療劑。

4 結(jié)語

免疫系統(tǒng)是生物體內(nèi)最為復(fù)雜且重要的系統(tǒng)，其復(fù)雜性在于機體內(nèi)存在不同的免疫器官發(fā)揮著不同的功能，且免疫細胞的種類亦多種多樣，而每種細胞又都有復(fù)雜的功能。其重要性是由于其擔(dān)負著機體的免疫防御、免疫監(jiān)視和免疫自穩(wěn)的功能，維持機體的正常功能與狀態(tài)。研究表明，機體絕大多數(shù)生物反應(yīng)都有免疫系統(tǒng)的參與，長久以來免疫系統(tǒng)一直是生物學(xué)研究的熱點。

隨著納米粒子對機體作用研究的不斷發(fā)展和深入，其特殊的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)在應(yīng)用中表現(xiàn)出較多的優(yōu)勢。近年來納米粒子在抗腫瘤免疫輔助治療、抗腫瘤靶向治療、免疫調(diào)節(jié)和基因疫苗開發(fā)等方面取得了明顯進展。

納米粒子作為抗腫瘤藥或疫苗載體治療疾病的同時，對免疫系統(tǒng)亦產(chǎn)生很大的影響，雖然對納米粒子已有了較多的研究，但對納米粒子對免疫系統(tǒng)的生物學(xué)效應(yīng)和毒理學(xué)效應(yīng)的認(rèn)識還十分有限。這方面的研究將受到越來越多的關(guān)注，成為納米生物醫(yī)學(xué)研究中一個新的重要方向。相信在不久的將來，人們一定會對納米粒子的生物學(xué)效應(yīng)有更加全面的了解與認(rèn)識，從而為人類的健康作出貢獻。

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