陳亨宇，付愛玲，趙寶全

(1.西南大學藥學院，重慶400715;2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所軍事毒理學研究室，北京100850)

應用斑馬魚模型評價納米粒子毒性機制的研究進展

陳亨宇1，2，付愛玲1，趙寶全2

(1.西南大學藥學院，重慶400715;2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所軍事毒理學研究室，北京100850)

納米科學是21世紀重點支柱領域之一。目前納米粒子的生物安全性體外實驗已取得了一些研究成果，但其體內(nèi)安全性評價，由于受到限制而進展緩慢。而斑馬魚是納米粒子體內(nèi)生物安全性評價的最佳模式生物。本文就目前國內(nèi)外開展的納米粒子體內(nèi)毒理學的研究方法和成果以及以斑馬魚作為模式生物研究納米粒子體內(nèi)毒性機制的優(yōu)勢進行了綜述。

納米粒子;毒理學;斑馬魚

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(1～100nm)或由它們作為基本單元構成的材料，大約相當于10個氫原子緊密排列在一起的直線長度。隨著納米科學的發(fā)展，越來越容易接觸到納米材料，因而其生物安全性問題也越來越受到重視［1］。納米級別的物質(zhì)，由于其具有極小的尺寸、巨大的比表面積、具有量子尺寸效應和宏觀量子隧道效應和易于積聚等諸多特點，其可能產(chǎn)生的毒性作用以及生理學響應等都與相同化學成分的非納米材料之間具有極大的不同。納米材料的納米結構特性對生物體是否產(chǎn)生影響目前還缺乏有力的證據(jù)［2］。因此，納米毒理學應該從納米結構特性尤其是其物理和化學特性以及其對生物整體系統(tǒng)的作用之間的聯(lián)系入手。近年來，很多研究成果都是在細胞培養(yǎng)的基礎上進行體外實驗得出的，都需要進行體內(nèi)實驗行進一步證明，否則可能會對后續(xù)研究產(chǎn)生誤導。納米材料對于生物是一種異物，可引起機體一系列反應如對異物的免疫應答等［3］。然而，目前動物體內(nèi)實驗的手段很少，比較成熟的只有亞慢性吸入毒性實驗、呼吸道滴注染毒實驗和暴露實驗等［4］，不能滿足進行多方面動物體內(nèi)實驗的要求。因此，加快納米粒子體內(nèi)毒理學的研究，建立系統(tǒng)完善的納米粒子體內(nèi)毒理學研究方法，是納米毒理學亟待解決的問題和挑戰(zhàn)。最近出現(xiàn)的斑馬魚動物模型，在納米毒理研究方面展示了許多。

1 納米粒子毒性

納米粒子毒性實驗大多處于描述性實驗階段，只有肺毒性機制是目前研究得較為全面和系統(tǒng)的領域。不過肯定的是，納米材料在生物體內(nèi)毒性作用及其可能機制，與納米材料的化學成分和其進入生物體內(nèi)后產(chǎn)生毒性作用的部位都有著密切的關聯(lián)［5］。

吸入是納米粒子進入體內(nèi)最可能的途徑之一［6-7］，因此對于納米粒子肺毒性的研究引起了重點關注。目前通過采用呼吸道滴注染毒或亞慢性吸入，已經(jīng)建立了比較完善的納米粒子肺毒性體內(nèi)實驗方法。Lam等［8］采用支氣管滴注染毒對單壁碳納米管的毒性進行了比較，小鼠血清中濃度達到10 mg·L-1時，部分小鼠死亡，且未死亡小鼠也出現(xiàn)了明顯的肺部中毒現(xiàn)象，出現(xiàn)間隙性肉芽腫。此外，對其他納米粒子如二氧化鈦納米粒子［9］等的肺毒性研究也觀察到了類似的現(xiàn)象，并通過對比實驗證明，納米材料的吸入毒性與其組成顆粒的粒徑大小有著密切關系，納米材料粒徑越小，比表面積越大，其毒性越強。這可能是由于隨著納米顆粒比表面積增大，納米顆粒的表面結合能和化學活性顯著增強，與機體內(nèi)源物質(zhì)發(fā)生生化反應的速率也就越高［10］。初步揭示了納米粒子產(chǎn)生肺毒性的機制。

納米粒子致肺毒性的機制，主要與氧化負荷、活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及納米粒子的沉積能力有關［5］。

氧化負荷一直都是微粒造成肺損傷的主要原因之一。氧化負荷的產(chǎn)生與不穩(wěn)定活性自由基的形成有直接聯(lián)系。自由基可以造成一系列的連鎖反應可能導致破壞性的氧化作用。當哺乳動物體內(nèi)受到異物入侵時，其中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞都可能在進行防御的同時產(chǎn)生毒性氧自由基，并在通過細胞膜釋放到周圍組織中去的同時產(chǎn)生應激氧化反應，導致細胞膜脂質(zhì)層斷裂，引起細胞凋亡［6］。ROS的產(chǎn)生與納米粒子的比表面積、粒子尺度和化學特性等粒子性質(zhì)具有更為密切的聯(lián)系。其產(chǎn)生機制主要是受到激發(fā)光或其他因素刺激影響。大部分納米粒子如碳納米管、量子點、富勒烯等都能產(chǎn)生ROS，可能造成生物體組織及細胞損傷。MacNee等［11］報道，碳黑微粒及其他一些納米粒子能夠在其表面釋放出活性氧自由基，并對細胞產(chǎn)生氧化應激，因而可能導致炎癥的產(chǎn)生。納米粒子在肺組織中的沉積能力與粒子的尺度具有密切聯(lián)系。這主要是通過其沉降和擴散等作用在肺組織里沉積下來，從而對肺組織及細胞產(chǎn)生長期的毒性影響。此外，也有文獻報道，樹枝狀TiO2粒子比紡錘狀和球狀TiO2粒子對巨噬細胞產(chǎn)生了更高的細胞毒性水平，因此認為納米粒子的形狀也能對納米粒子的毒性產(chǎn)生影響［12］，這可能也是因為不同形狀的粒子的沉積能力不同所造成的。

納米粒子的化學組成如重金屬離子等已經(jīng)被證明具有毒性，也可能在生物體內(nèi)通過與一些內(nèi)源物質(zhì)相互作用而釋放出來，造成與該化學成分相似的毒性影響［2］。

2 納米粒子生物體內(nèi)毒性實驗研究常用方法

納米粒子經(jīng)肺染毒是目前研究最多的一個領域，其方法已有很多報道，其中，呼吸道滴注染毒法對納米粒子肺毒性的研究因其操作簡便，定量容易的特點［13］而應用最多。Muller等［14］采用呼吸道滴注染毒方式，將單壁碳納米管和碎納米管分別注入SD大鼠肺中，發(fā)現(xiàn)兩者均對大鼠肺部組織造成纖維化反應和炎癥反應，并且60 d后仍大量留存于肺部組織中，且導致支氣管內(nèi)腔形成富膠原質(zhì)的肉芽腫大，并伴隨周圍組織出現(xiàn)肺泡炎。這是由于碳納米管在空氣中積聚成塊并滯留于肺組織中導致的。Afaq等［15］采用同樣的給藥方式，研究對TiO2納米粒子對大鼠肺部組織所造成毒性影響，發(fā)現(xiàn)在納米粒子侵入大鼠肺部后，雖然引起巨噬細胞增多，谷胱甘肽過氧化酶和還原酶等抗氧化酶活性增加，但并未完全消除納米粒子的毒性影響，大鼠肺部組織仍然出現(xiàn)炎癥反應。還有吸入染毒法，包括常規(guī)吸入染毒法和咽部吸入染毒法。常規(guī)吸入染毒法通常是采用染毒中毒柜將動物鼻部暴露于柜內(nèi)氣體中染毒。咽部吸入染毒法則是將動物舌部固定，并將含納米粒子的緩沖液置于其舌后部直至其完全自動揮發(fā)進入空氣中散開。Johnston等［16］通過此方法使煙形態(tài)的聚四氟乙烯顆粒進入SD大鼠肺部組織，在粒子濃度達到50 μg·m-3時，15 min大鼠即會出現(xiàn)急性中毒癥狀。當聚四氟乙烯在氬氣里剛被制備出來時，顆粒是獨立存在的，暴露于這樣的粒子中并不會出現(xiàn)中毒癥狀。在空氣中制造出的氣相聚四氟乙烯同樣不具有毒性。只有當顆粒以氣溶膠形式存在時，才會造成很高的肺毒性。Shvedova等［17］也通過咽部吸入法使單壁碳納米管粒子進入小鼠肺部，并觀察到1～3 d小鼠肺部出現(xiàn)炎癥反應，并伴有肉芽腫，并具有劑量依賴性。此2種方法由于氣溶膠制備困難［18］，難以確定納米粒子進入體內(nèi)(肺部及血液)的時間和劑量，長時間固定及給藥可能產(chǎn)生物理損傷，動物安全問題等缺點，因此成果也很少。但由于相比呼吸道滴注染毒法，兩者進入到肺部時的微粒形態(tài)有很大差別，水懸液遵循液體動力學而氣溶膠遵循氣體動力學，因而其到肺部組織的深度及部位都有可能不同，因此對于肺部的毒性作用可能會產(chǎn)生很大的差別，而在日常生活中，可能由呼吸系統(tǒng)接觸到的納米粒子通常是第二種形態(tài)，因此，需要更多的研究來證明此形態(tài)的納米粒子對肺部產(chǎn)生毒性的作用機制和作用結果。

關于納米粒子由其他途徑，如胃腸道、血管注射和皮膚等進入生物體，特別是哺乳動物體內(nèi)，造成其他內(nèi)臟器官損傷的研究目前相對較少。

暴露是常用的研究納米材料毒性的方法之一，對象為水生生物(包括水生動植物如水蚤、水稻等)及細菌。通常直接給藥后在固定時間內(nèi)觀察取樣，簡便直接。Lin等［19］用透射電鏡觀察了植物的葉片細胞能夠吸收C70粒子，進入細胞中的C70粒子會聚集成小團并留存在細胞壁和液泡中，并在透射電鏡圖像中呈暗層結構。而對于納米粒子對陸生哺乳動物通過皮膚接觸產(chǎn)生毒性還鮮有開展，僅較常用于致敏實驗［5］，這可能與此途徑染毒毒性并不明顯有關。目前不能確定納米粒子能否通過此途徑進入哺乳動物體內(nèi)［20］。

胃腸道和血管注射給藥更多用于納米粒子作為藥物載體，對于靶向性，穿透性，運載能力等研究較多，而對于毒理方面的成果較少。其方法與常規(guī)毒理方法基本一致。

各種碳納米粒子，包括碳納米管、石墨單原子層等，因其不含重金屬成分等毒性物質(zhì)，而成為目前生物傳感器、藥物運輸及分子成像等多方面的研究重點。Yang等［21］在對聚乙二醇(PEG)修飾劑修飾的碘(125I)標石墨氮原子層納米材料的分布、藥代動力學、毒性等研究表明，靜脈注射給予小鼠后，主要短期存在于肝等的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織中，且在血液和組織等均發(fā)現(xiàn)明顯毒性，因此其在生物醫(yī)學有廣闊應用前景。Yamago等［22］將水溶性呋侖碳粒子ig給予大鼠，發(fā)現(xiàn)消化道吸收效率很低，大部分都隨糞便排出體外。而采用靜脈注射，呋侖碳粒子能迅速分布，甚至能穿越血腦屏障并長期留存。還發(fā)現(xiàn)，其可能造成急性毒性很低，但其難以被排出體外可能是其造成較嚴重的慢性毒性的原因。Kolosnjaj-Tabi等［23］將高濃度的單壁碳納米管粒子ig給予小鼠，同樣未發(fā)現(xiàn)死亡及生長和行為障礙。而ip給藥，粒子能在體內(nèi)結合成纖維狀結構并在其聚集程度達到一定量后導致肉芽腫的形成，其在細胞中的留存時間也超過了5個月。這表明了粒子聚集程度對其毒性具有決定性影響。

系統(tǒng)研究納米粒子由非呼吸道吸入進入生物體造成的毒性及機制，建立完善的實驗方法，是進一步開展的方向。

3 一種納米毒理學研究的新方法——斑馬魚模型

斑馬魚(zebrafish)是重要的模式脊椎動物。其成魚個體小，適合高密度養(yǎng)殖，3個月即可性成熟，卵生且排卵量大，一次可排卵數(shù)百粒，胚胎發(fā)育迅速，適應性較強，易于養(yǎng)殖，因此斑馬魚作為實驗模式生物，可以獲得大量樣本，減少誤差，同時能大幅度縮短實驗周期。斑馬魚胚胎體外受精發(fā)育，其胚胎以及幼生期(約20日齡內(nèi))均完全或部分透明，很容易在活體狀態(tài)下分析和觀察器官和組織變化［24］而不需要病理切片，且能通過滲透作用吸收小分子藥物［25］。此外，近年來斑馬魚基因組學發(fā)展迅速，已知的30 000余基因已被證實與人類相似度高達87%［26］，在對其進行的大規(guī)模遺傳篩選中得到的許多突變顯現(xiàn)與人類疾病相似的表型，同時許多斑馬魚基因與哺乳動物同源，其中很多基因已經(jīng)被克隆并被發(fā)現(xiàn)兩者功能相似，這表明斑馬魚是一種優(yōu)良的人類疾病模型。

斑馬魚在毒理學研究中應用廣泛，特別是其可以對水體污染物做出相應的行為反應，對水質(zhì)污染與毒性物質(zhì)反應靈敏，因此被廣泛用于水質(zhì)監(jiān)測，甚至目前有些國家已經(jīng)制定了用斑馬魚檢測水質(zhì)毒性的標準，如我國的GB/T 13267-91《水質(zhì)物質(zhì)對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法》適用于水中單一化學物質(zhì)以及工業(yè)廢水的毒性測定［27］。

斑馬魚進行毒性和毒理研究有了初步進展。常用的是4日齡毒性分析模型。即從受精卵發(fā)育開始4 d內(nèi)，包括胚胎和孵化等發(fā)育階段，在各不同階段考察毒性成分對斑馬魚形態(tài)學、生理學和行為學等多方面所造成的影響，并對各方面的毒性終點進行選擇和量化［28］。采用從受精卵發(fā)育開始4 d內(nèi)斑馬魚進行實驗，除了其優(yōu)點外，還因為不同物種的脊椎動物在早期發(fā)育階段具有很強的相似性，且其在這一階段對于外來化學物質(zhì)的影響能夠產(chǎn)生更靈敏的反應［24］。

利用斑馬魚發(fā)育周期短，數(shù)量大和對毒性物質(zhì)反應靈敏的特點，Zhu等［29］采用暴露法使斑馬魚胚胎染毒，考察了氧化鋅、二氧化鈦和氧化鋁納米粒子水懸液對斑馬魚的發(fā)育毒性影響，其納米粒子在水懸液平均粒徑為180，230和930 nm，并將其與普通材料做比較，顯示氧化鋅納米材料與其非納米材料水懸液均延遲斑馬魚胚胎以及幼魚發(fā)育，降低其存活量和孵化率，并造成了組織傷害。斑馬幼魚暴露在氧化鋅納米材料與其非納米材料水懸液中，均產(chǎn)生嚴重的組織潰瘍。另2種則不明顯。這可能與胚胎膜的保護作用有關。而與肺毒性不同的是，斑馬魚胚胎及幼魚暴露于氧化鋅、二氧化鈦和氧化鋁納米材料所產(chǎn)生的毒性反應與暴露于其對應的非納米材料并無不同。這表明其毒性可能是由于釋放到水中的金屬離子引起的而與納米結構無關。這是最早關于金屬納米粒子發(fā)育毒性的報道，為后續(xù)的研究［30］提供了重要的參考資料。

Ispas等［31］選用鎳納米粒子30，60和100 nm與聚集成樹枝狀的60 nm鎳納米粒子作比較時發(fā)現(xiàn)，樹枝狀納米粒子具有明顯的毒性，而非聚集成樹枝狀納米粒子則不具有明顯毒性，這證明粒子形狀能夠?qū){米粒子的毒性產(chǎn)生重要影響。而非樹枝狀納米粒子也檢測到有部分崩解，其輕微毒性可能也是由此而引起。對于形狀不同造成的毒性差別，可能主要是樹枝狀粒子更容易被吸附在腸道中而形成聚集所造成的。

Griffitt等［32］將斑馬魚置于可溶解銅和80 nm銅納米粒子水懸液中，發(fā)現(xiàn)會對斑馬魚的鰓部造成損傷，并造成急性毒性。其48 h的LC50為1.5 mg·L-1。其中，斑馬魚的鰓部是納米銅粒子造成損害的首要器官，主要損傷包括形態(tài)學影響以及基因表達的影響，其機制目前尚不清楚。

斑馬魚胚胎完全透明，可實時監(jiān)控，Bar-Ilan［33］等對膠態(tài)金納米粒子和銀納米粒子3，10，50和100 nm對斑馬魚胚胎所造成的毒性影響進行了評價，兩者均對斑馬魚胚胎造成了很高的死亡率且同種粒子由于粒徑不同而造成的毒性差異不明顯，其中銀納米粒子120 h后致死率幾乎達到100%，而使用與金納米粒子最小亞致死量相同劑量的銀納米粒子處理斑馬魚胚胎，只會造成各種形態(tài)學畸形。此外，兩者在斑馬魚體內(nèi)具有明顯不同的毒性分布，這揭示了納米粒子毒性機制的多樣性和復雜性以及納米粒子化學的重要影響。

King-Heiden等［34］利用斑馬魚模型廉價快速、易于分辨毒性特征的特點，選用以CdSe為核，外包ZnS外殼并特殊處理的量子點制成水懸液，然后將斑馬魚胚胎置于其中，發(fā)現(xiàn)量子點的水懸液穩(wěn)定性及毒性影響很大程度上均受到其外殼的影響，而其毒性特征并未強烈表現(xiàn)出與Cd毒性相同，表明量子點在生物體內(nèi)難以被降解分離，其毒性可能是其納米材料的特性或者外殼的化學成分引起的而非金屬離子的釋放所造成的。其納米材料的特性所引起的毒性反應主要還是在生物體內(nèi)產(chǎn)生ROS從而產(chǎn)生氧化壓力，造成細胞損傷。將斑馬魚同時暴露于納米粒子與還原性谷胱甘肽混合溶液中時，產(chǎn)生了不同的毒性反應，證明了氧化應激對于納米材料毒性的影響，但是結果并不穩(wěn)定。Usenko等［24］也認為氧化應激是呋倫碳納米粒子造成細胞損傷的主要機制。

總之，目前納米粒子對斑馬魚產(chǎn)生毒性的機制研究表明，納米粒子崩解或釋放出的毒性化學物質(zhì)以及ROS產(chǎn)生的氧化應激是最可能的導致毒性的原因。

除暴露法之外，目前尚未發(fā)現(xiàn)其他方法考察納米粒子對斑馬魚的毒性的文獻，也未發(fā)現(xiàn)納米粒子對斑馬魚發(fā)育毒性之外的其他毒性的文獻，這都還有待于進一步研究，如可利用其生長期短，排卵量大等特點研究其生殖毒性。

4 展望

納米粒子材料作為一類全新概念的新型材料，具有許多獨有特性，已廣泛應用于許多領域。然而，納米粒子生物安全性的研究仍然停留在細胞實驗以及描述性實驗的階段，對于其體內(nèi)生物毒性以及其機制的研究仍然甚少。在未來研究中，應該建立一套能全面、合理和系統(tǒng)的評價納米粒子材料尺寸、形狀、表面化學及其生物體內(nèi)分布的相關性以及其致毒性機制的體內(nèi)實驗方法，以便能全面分析納米結構獨特的物理性質(zhì)對生物體所產(chǎn)生的影響，從而進一步研究減少其對生物體所可能造成的傷害。而斑馬魚作為一種優(yōu)秀的模型動物，能夠迅速敏捷地檢測納米粒子對生物體產(chǎn)生的毒理作用，在納米毒理學研究領域必然會得到廣泛應用。

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Progress in application of zebrafish model in evaluation of nanotoxic mechanism

CHEN Heng-yu1，2，F(xiàn)U Ai-ling2，ZHAO Bao-quan1
(1.College of Pharmaceutical Science，Souhwest University，Chongqing400715，China;2.Department of Military Toxicology，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China)

Abstruct:Science in nanometer scale，one of the most important research fields in 21 century.In present，achievements that have been made in nanotoxicity are basically based on in vitro systems.However，in vivo study developed tardily.Zebrafish，a kind of mode organism，which has more advantages than others in toxicity assessment，will be used more and more wildly in this field.This review summarized some investigative methods，results of in vivo nanostructures toxicology and the advantages of the mode organism——zebrafish to provide some help for its development and the methods being systematism.

nanoparticles;toxicology;zebrafish

ZHAO Bao-quan，E-mail:baoquan9838@sina.com，Tel:(010)66874609

R99

A

1000-3002(2012)02-0251-04

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.02.023

2011-05-30接受日期:2011-12-26)

(本文編輯:付良青)