王飛鵬，黃恩炯，肖 武，宋誠本，王宇平

吸血蠓（Blood－sucking midges）是一類微小型昆蟲，屬雙翅目（Diptera）蠓科（Ceratopogonidae），幾乎廣泛分布于世界各地，可攜帶數(shù)十種人獸共患病病原，是醫(yī)學(xué)昆蟲的重要類群之一。蠓的分類研究最早記載于林奈的《Systema Nat urae》中，距今已有250余年的發(fā)展歷史，形成了較為成熟的分類體系［1］。但由于蠓科昆蟲中存在許多具有多處相似特征的隱種（cr yptic species）組成的復(fù)合體（co mplex）或種團（gr oup），沿用傳統(tǒng)靠識別形態(tài)學(xué)特征的方法對這類群昆蟲進行分類和鑒定往往較為困難，進而也影響了對其系統(tǒng)進化及其與病原生物關(guān)系的深入研究。因此，尋找可靠的分類鑒定方法，以期快速、準確地識別蠓科昆蟲，尤其是吸血蠓，是現(xiàn)代昆蟲分類學(xué)家研究的重要內(nèi)容之一，也是蠓傳疾病防治工作的基礎(chǔ)。

分子分類技術(shù)是以遺傳物質(zhì)DNA序列分析為依據(jù)來闡明物種間的差別，從分子水平上快速而準確地鑒別物種。它是分子生物學(xué)、計算機科學(xué)與傳統(tǒng)分類學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，作為一種嶄新的分類學(xué)技術(shù)，極大彌補了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的缺陷，已引起越來越多生物學(xué)家們的重視。蠓科昆蟲的分子分類研究起步較遲，從1992年研究變翅庫蠓（Culicoides variipennis）種群的基因差異起［2］，才陸續(xù)有報道。近年來，隨著以PCR基礎(chǔ)的DNA序列測定方法的建立和廣泛使用，核糖體DNA（r DNA）的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、線粒體 DNA（mt DNA）的細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）、細胞色素C氧化酶亞基Ⅱ（COⅡ）等基因逐漸受到蠓科分類學(xué)家們的重視。本文就近幾年來吸血蠓的分子分類研究進展綜述如下。

1 r DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的應(yīng)用

r DNA廣泛分布于各種生物細胞中，在功能上具有高度的保守性和良好的時鐘性，其測定序列常用于物種分類和生物間系統(tǒng)發(fā)育的研究，尤其是物種的種間分類研究［3－5］。目前r DNA作為遺傳標記在寄生蟲鑒定中的應(yīng)用日趨廣泛，前人對此作了詳盡的描述［6－8］。ITS是位于r DNA 上18S和28S基因之間的區(qū)域片段，包括ITS1和ITS2兩段序列，由于該區(qū)域不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小，進化速度較其他區(qū)域快，具有種內(nèi)變異小而種間變異大的特性，加上協(xié)同進化作用保證了該片段在基因組不同單元間的一致性，因而適合進行各種分子操作，是較理想的種間鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的遺傳標志［9－12］。近幾年來國內(nèi)外對ITS序列標記在蠓科昆蟲中的研究和應(yīng)用越來越多，r DNA的ITS1和ITS2序列在蠓類昆蟲的鑒定中發(fā)揮了重要的作用。

1．1 ITS1序列標記 2004年，Cetre－Sossah等［13］通過設(shè)計特異性引物，利用ITS1序列標記建立了庫蠓屬（Culicoides spp．）和殘肢庫蠓（C．i micol a）的分子分類方法。研究發(fā)現(xiàn)：包括殘肢庫蠓（C．i micol a）在內(nèi)的9種庫蠓的ITS1序列長度范圍在316－500 bp，其中，殘肢庫蠓（C．i micol a）有一條303 bp的特異性條帶；之后，Cetre－Sossah等［14］又提出以ITS1作為靶標基因的實時熒光定量PCR技術(shù)，該技術(shù)特異性強、靈敏度高，在殘肢庫蠓（C．i micol a）的監(jiān)測和研究項目上具有廣闊的應(yīng)用前景。Perrin等［15］再次對殘肢庫蠓（C．i micol a）進行ITS1序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析，同源性高達99．8%，驗證了ITS1在物種進化和遺傳關(guān)系研究中的價值。Mathieu等［16］利用PCR技術(shù)對不顯庫蠓復(fù)合體（obsolet us co mplex）的ITS1序列進行測定發(fā)現(xiàn)：雪翅庫蠓（C．chiopter us）、不顯庫蠓（C．obsoletus）、蘇格蘭庫蠓（C．scoticus）、丘夫庫蠓（C．dewul f i）和山丘庫蠓（C．montanus）的同源性分別為98．93%、99．43%、98．33%、99．1%和98．47%，對這5種蠓的ITS1片段進行PCR擴增表明，不顯庫蠓復(fù)合體均有一條166 bp的條帶，但雪翅庫蠓（C．chiopter us），丘夫庫蠓（C．dewul f i）和不顯庫蠓（C．obsoletus）還分別有一條78 bp、117 bp、302 bp的條帶，山丘庫蠓（C．montanus）還有125 bp和302 bp條帶，而蘇格蘭庫蠓（C．scoticus）僅見166 bp這唯一的條帶。從遺傳關(guān)系看，不顯庫蠓復(fù)合體（obsolet us co mplex）中的丘夫庫蠓（C．dewul f i）與殘肢庫蠓（C．i micol a）最為親近。Stephan［17］采用降落PCR法擴增、克隆丘夫庫蠓（C．dewul f i）的ITS1基因。結(jié)果表明：丘夫庫蠓（C．dewul f i）有一條295 bp的特異性條帶，這一結(jié)論為丘夫庫蠓（C．dewul f i）在不顯庫蠓復(fù)合體中的準確鑒定提供了新的依據(jù)。Matsu moto［18］研究提出庫蠓的ITS1基因可根據(jù)堿基的缺失或插入情況不同分為長型和短型兩種類型，并認為長型ITS1是庫蠓ITS1基因的原型，一些短型ITS1庫蠓是由于堿基缺失所引起，而二囊亞屬有其ITS1特異序列，并形成單系群。Li等［19］根據(jù)荒川庫蠓（C．a(chǎn)r aka wai）、淺色庫蠓（C．a(chǎn)lbicans）、肘臂庫蠓（C．cubitalis）等10種庫蠓的ITS1基因片段長度，將10種庫蠓分為457－469 bp和316－347 bp兩群。從總體上看，10種庫蠓ITS1片段在288－388 bp的范圍出現(xiàn)一個高度保守的區(qū)域，由此提出可以在1－287 bp和385－500 bp范圍內(nèi)設(shè)計特異性引物，以ITS1為擴增的靶標序列，通過PCR的方法來鑒別各種庫蠓。

1．2 ITS2序列標記 Go mulski等［20］對包括灰黑庫蠓復(fù)合體（pulicaris co mplex）在內(nèi)的11種庫蠓的r DNA－ITS2區(qū)基因進行克隆和序列分析，推斷意大利主要庫蠓亞屬的系統(tǒng)發(fā)育。結(jié)果認為庫蠓亞屬是由Culicoides sensu stricto，Sil vicol a，Hoff mania Fox和迄今不詳?shù)腇agineus復(fù)合體4個家系組成的多源聚合體。提出ITS2作為吸血蠓PCR擴增的靶標序列，不僅有利于鑒定蠓新種，還能有效輔助澄清庫蠓亞屬里的同種異名，分子鑒定與形態(tài)學(xué)鑒定相佐證能夠解決吸血蠓形態(tài)學(xué)鑒定中的難題。Monaco等［21］提出以ITS2為標記基因的實時熒光定量PCR技術(shù)準確率高，比常規(guī)PCR更適合運用于不顯庫蠓復(fù)合體（obsolet us co mplex）的快速鑒定，特別是在鑒定大規(guī)模不顯庫蠓復(fù)合體（obsolet us co mplex）標本的情況下更具高效性。胡友蘭和李國清［22］對荒川庫蠓（C．a(chǎn)r aka wai）、變翅庫蠓（C．variipennis）和殘肢庫蠓（C．i micol a）等6種雙翅目昆蟲r DNA－ITS2的研究表明，雙翅目昆蟲ITS 2片段大小在不同屬間的差異很大，即使是同一屬的庫蠓，同源性也不高，最大為40．9%［荒川庫蠓（C．a(chǎn)r aka wai）與殘肢庫蠓（C．i micol a）］，荒川庫蠓（C．a(chǎn)r aka wai）與變翅庫蠓（C．variipennis）的同源性稍低，為32．7%。從而驗證了真核生物ITS2序列具有高度變異性的特點，同時也說明了ITS2片段作為庫蠓PCR鑒別的靶標序列，能提供比較豐富的遺傳信息。

2 線粒體DNA（mt DNA）的應(yīng)用

線粒體DNA是細胞內(nèi)相對獨立的基因組，具有結(jié)構(gòu)簡單、基因組小、易分離純化、序列順序和組成一般比較保守、嚴格遵循母系遺傳、單拷貝、進化速率較核DNA快、無重組等特點，它的傳遞、重組、分離、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄都可應(yīng)用分子生物學(xué)的許多手段和方法進行分析，是分子進化遺傳研究領(lǐng)域的熱點［23－24］?，F(xiàn)已知線粒體的基因組至少含有13個蛋白質(zhì)基因，其中僅COⅠ、Cyt b、ND4、ND5這4個基因滿足基因插入和缺失現(xiàn)象較少、長度在900 bp左右這兩個條件，但ND4、ND5進化太快，不可能設(shè)計出通用引物，限制了它們作為全面DNA鑒定系統(tǒng)的目標基因［25］。近年來線粒體COⅠ、COⅡ基因在蠓科昆蟲分類上的應(yīng)用較為廣泛，尤其是COⅠ基因，在一定程度上可作為傳統(tǒng)分類學(xué)的補充驗證，推動了蠓科昆蟲分子分類的研究進展，但Cyt b在蠓的分子分類中至今未見報道。

2．1 細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）基因 自Hebert等［26－28］提出DNA條形碼技術(shù)并在全球開展相關(guān)的協(xié)作研究后，COⅠ基因作為條形碼技術(shù)的標準目的基因推動了以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的物種鑒定技術(shù)，目前已經(jīng)在脊椎動物和昆蟲中得到廣泛研究［29－32］。在吸血蠓分子鑒定研究方面，Linton等［33］對殘肢庫蠓復(fù)合體（C．i micol a complex）中5種庫蠓的COⅠ基因進行序列測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：殘肢庫蠓復(fù)合體（C．i micol a complex）種間差異大，存在顯著的A－T堿基顛換。采用鄰接法（NJ）和最大簡約法（MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分子系統(tǒng)樹顯示各蠓種間區(qū)別明顯。Dallas等［34］對殘肢庫蠓復(fù)合體（C．i micol a complex）的CO I基因研究表明，殘肢庫蠓CO I基因單體型的地理結(jié)構(gòu)與藍舌病病毒（BTV）的血清型具相關(guān)性。Pages and Sarto I Monteys［35］通過設(shè)計特異性引物，對CO I基因進行半巢式PCR擴增、克隆，成功鑒定不顯庫蠓（C．obsoletus）和蘇格蘭庫蠓（C．scoticus）雌蟲，并且認為形態(tài)學(xué)鑒定吸血蠓并不完全可靠，CO I基因可作為吸血蠓種間鑒定的遺傳標志。Nolan等［36］也利用基于CO I基因的PCR方法快速準確地鑒定灰黑庫蠓復(fù)合體（pulicaris co mplex）和不顯庫蠓復(fù)合體（obsolet us co mplex）。Pages等［37］又報道利用條形碼技術(shù)鑒定識別了庫蠓屬中的隱存種；同年，Sch wenkenbecher等［38］對不顯庫蠓復(fù)合體［obsolet us co mplex，含丘夫庫蠓（C．dewul f i）］與灰黑庫蠓復(fù)合體（pulicaris co mplex）幼蟲的CO I基因進行多重PCR擴增、克隆及序列分析。研究表明CO I基因可作為分子標記用于吸血蠓幼蟲的高通量鑒定。幼蟲的鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)：僅丘夫庫蠓（C．dewul f i）在糞堆中有孳生，而其余庫蠓幼蟲多數(shù)孳生于水流或積水濕泥，這對掌握吸血蠓幼蟲的生態(tài)習(xí)性具有重要指導(dǎo)意義。Augot等［39］利用基于CO I基因的條形碼技術(shù)，同時結(jié)合對頭部、生殖器和胸部的形態(tài)測量，成功鑒定了88份不顯庫蠓（C．obsoletus）和蘇格蘭庫蠓（C．scoticus）雌蟲標本。但是，利用基于CO I基因的DNA條形碼技術(shù)鑒定吸血蠓在我國至今未見報道。

2．2 細胞色素C氧化酶亞基Ⅱ（COⅡ）基因 COⅡ序列具有很高的趨異性，尤其是在一些雙翅目和膜翅目昆蟲中，COⅡ基因序列和氨基酸順序均表現(xiàn)出高度的趨異性［40］，因此，COⅡ基因序列在這類昆蟲的進化機制及系統(tǒng)發(fā)育研究方面是一種非常有效的分子標記。通過分析臺灣地區(qū)臺灣蠛蠓（Lasiohelea tai wana）的COⅡ基因序列發(fā)現(xiàn)：不同臺灣蠛蠓（La．tai wana）個體間核苷酸分化程度可高達2．7%。群體內(nèi)以及群體間的平均變異水平在0．7% 左右。因此，遺傳交流可能是導(dǎo)致如今臺灣地區(qū)臺灣蠛蠓（La．tai wana）種群組成多元化的原因［41］。對蚊科、蠓科、搖蚊科以及蚋科等昆蟲的COII序列分析表明蠓群體間的分化程度較大，其在所屬的科中屬于較古老的種，而且相對于其他雙翅目長角亞目昆蟲具有更為顯著的序列進化［42］。

3 結(jié) 語

尋求快速、準確、可靠的吸血蠓種類鑒定技術(shù)，不僅是口岸一線檢疫工作人員開展檢疫工作和有效防制蠓傳疾病的重要基礎(chǔ)，更是生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)新種和隱存種，重建物種和高級階元的演化關(guān)系，豐富生物資源的有效途徑。雖然分子分類與鑒定技術(shù)興起時間較晚，但其正以穩(wěn)步、快速的態(tài)勢發(fā)展。吸血蠓分子水平上的研究不僅有助于準確地分類鑒定，也將有利于對其媒介功能的研究。目前，分子生物學(xué)技術(shù)已多見于吸血蠓種團、復(fù)合體的分類鑒別中，少數(shù)也涉及到種群分化的研究，這將為解決蠓科研究中存有爭議的問題提供指導(dǎo)性資料。當(dāng)今，國內(nèi)外學(xué)者對吸血蠓的分子分類已做了大量研究工作，但都仍處于實驗室研究階段，各種分子分類應(yīng)用的靶標基因有優(yōu)點也存在其一定的局限性。核糖體DNA上的ITS區(qū)域序列進化速度快，在物種水平上變異較大，序列多態(tài)性強并含有足夠量的遺傳信息，已被廣泛用于物種分類及系統(tǒng)進化研究，但是這些基因中存在大量的插入和缺失現(xiàn)象，從而使序列比對受到障礙，不便操作，而且還容易造成錯誤的比對［43］?；诰€粒體基因編碼的DNA條形碼技術(shù)及其應(yīng)用前景雖被眾多學(xué)者所看好，但也有學(xué)者認為如此短的DNA片段不能提供物種水平的可靠信息，完全依靠 DNA 條形碼會導(dǎo)致鑒定錯誤［44－45］。更有人認為采用DNA條形碼技術(shù)將是一種倒退，會將分類學(xué)退回到類型學(xué)［46－47］。在利用任何一個基因或多個基因片段進行物種分類和種屬鑒定時，不能只考慮所選用標記基因的片段長度，而應(yīng)該結(jié)合序列組成及其同源性綜合評價。例如，Sch wenkenbecher［48］選用ITS1、ITS2和 COⅠ3個靶標基因通過系統(tǒng)發(fā)育分析提出了丘夫庫蠓（C．dewul f i）不應(yīng)屬于不顯庫蠓復(fù)合體的觀點。鑒于此，分子分類技術(shù)依舊無法完全取代傳統(tǒng)的吸血蠓分類鑒定方法，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)手段不能完全拋棄。

總之，分子分類技術(shù)目前所表現(xiàn)出的局限性不應(yīng)是其應(yīng)用和發(fā)展的阻礙，對于其面臨的問題，可以探索、嘗試新的分子標記及多個分子標記相結(jié)合使用來解決，同時也不排斥其他分類方法，包括生物化學(xué)、計算機數(shù)值分類學(xué)和細胞遺傳學(xué)等方法，多層次、多方面、系統(tǒng)地研究吸血蠓分類，這樣就更能反映吸血蠓的種群進化和親緣關(guān)系。今后，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，吸血蠓的分子分類技術(shù)也將不斷地進步和成熟。充分發(fā)揮分子分類技術(shù)的獨特優(yōu)勢，利用分子分類技術(shù)與傳統(tǒng)的分類方法相互佐證，將大大有助于吸血蠓的分類鑒定。

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