曾憲思 白 潔 (昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650224)

磷酸二酯酶(PDEs)是一個(gè)多基因家族。PDEs催化環(huán)腺苷酸(cAMP)和環(huán)鳥苷酸(cGMP)分別生成AMP和GMP，這是細(xì)胞內(nèi)降解cAMP和cGMP的唯一途徑。PDEs可以分為11個(gè)家族，分別為1～11，其中PDE4能特異性地水解cAMP。PDE4又可以分為A、B、C和D 4個(gè)亞家族。關(guān)于PDE4D基因與缺血性腦卒中相關(guān)性的研究結(jié)果不一致。本文將就PDE4D和缺血性腦卒中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 PDE4D基因、蛋白結(jié)構(gòu)及其功能

1.1 PDE4D基因 PDEs由20個(gè)基因組成，根據(jù)氨基酸序列同源性、酶作用底物特異性和藥理學(xué)性質(zhì)將它們分成11個(gè)家族。11個(gè)PDEs的任一個(gè)都包括1～4個(gè)不同的基因〔1〕。PDE4有A、B、C、D四個(gè)亞家族。PDE4D基因在人類染色體中定位于5q12，大小約為1.6 Mb，包含24 個(gè)外顯子〔2〕。

1.2 PDE4D蛋白結(jié)構(gòu) PDE4D基因通過使用多個(gè)啟動(dòng)子和選擇性拼接編碼若干個(gè)功能蛋白亞型，分別為PDE4D1～9。這些蛋白的催化區(qū)和C－端是一致的，N－端差異較大。根據(jù)N－端是否含有上游保守序列(UCR)可以將它們分成長(zhǎng)式結(jié)構(gòu)、短式結(jié)構(gòu)和超短式結(jié)構(gòu)。長(zhǎng)式結(jié)構(gòu)包含上游保守序列1和2(UCR1和UCR2)，短式結(jié)構(gòu)缺少UCR1，超短式結(jié)構(gòu)缺少UCR1和部分UCR2。UCR1和UCR2分別含有60和80個(gè)氨基酸殘基，它們由連接區(qū)1(LR1)連接，LR1長(zhǎng)度大約為24個(gè)氨基酸殘基，UCR2通過LR2與催化區(qū)相連，LR2大小為10～28個(gè)氨基酸。在人類中長(zhǎng)式結(jié)構(gòu)有PDE4D3～5蛋白和PDE4D7～9，短式結(jié)構(gòu)只有 PDE4D1，超短式結(jié)構(gòu)有 PDE4D2 和 PDE4D6〔1，3〕。

1.3 PDE4D的功能 PDE4在體內(nèi)廣泛表達(dá)，主要分布于各種炎性細(xì)胞內(nèi)，包括肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞等。cAMP和cGMP是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，它們?cè)谏窠?jīng)傳遞、肌肉收縮、免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、代謝、視覺、嗅覺、記憶、胞吐作用等生理過程中起重要作用。而細(xì)胞內(nèi)cAMP和cGMP的合成和降解都要受到嚴(yán)格的調(diào)控:腺苷酸環(huán)化酶(AC)和鳥苷酸環(huán)化酶(GC)分別將ATP和GTP轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的環(huán)化結(jié)構(gòu)形式，而PDEs催化cAMP和cGMP水解，開環(huán)，分別生成非活性形式的5′AMP和5′GMP。這是細(xì)胞內(nèi)降解cAMP和cGMP的惟一途徑。在11個(gè)PDEs家族中有8個(gè)能降解cAMP，PDE4能特異性降解cAMP。有證據(jù)表明cAMP信號(hào)是區(qū)域化的〔4〕。PDE4在不同時(shí)間調(diào)節(jié)cAMP濃度改變，所引起的cAMP介導(dǎo)的信號(hào)途徑不同。在正常細(xì)胞中PDE4D占PDE4活性的60% ～70%，而在炎癥細(xì)胞中 PDE4D至少占PDE4活性的80%。PDE4D對(duì)炎癥、血小板穩(wěn)定性、損傷應(yīng)答、血管生成的影響不同，在腦卒中發(fā)生發(fā)展過程中起不同的作用。deCODE研究組和其他的研究者證實(shí)，PDE4通過各亞型的相對(duì)表達(dá)量來調(diào)節(jié)PDE4D活性。PDE4D在其表達(dá)的組織中調(diào)節(jié)生物活性中扮演著復(fù)雜的角色〔5〕。

1.4 PDE4D的短期調(diào)節(jié)

1.4.1 UCR1和UCR2以及催化區(qū)的作用 PDEs的N－端具有調(diào)節(jié)功能，UCR1和UCR2對(duì)PDEs的活性具有重要的調(diào)節(jié)作用。UCR1疏水的C－端與UCR2親水的N－端相互作用，UCR1/2又與PDE4D催化區(qū)相作用，從而調(diào)節(jié)PDE4D活性。UCR1和UCR2介導(dǎo)cAMP－依賴蛋白激酶(PKA)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2(ERK2)磷酸化。PKA可以將UCR1中特定位點(diǎn)的絲氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而提高了長(zhǎng)式PDE4D活性。而絲氨酸殘基在整個(gè)家族中極其保守，對(duì)酶活性的維持起重要作用。PKA磷酸化破壞了處于低活性狀態(tài)的離子對(duì)及UCR1與UCR2的相互作用，導(dǎo)致其構(gòu)象改變，激活長(zhǎng)式PDE4D。ERK可以將催化區(qū)絲氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致PDE4D活性降低。這種抑制作用是暫時(shí)的:當(dāng)細(xì)胞外的刺激作用于細(xì)胞膜后，產(chǎn)生一系列信號(hào)。cAMP是信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要信使，當(dāng)細(xì)胞外信號(hào)分子(配體)與G蛋白耦聯(lián)受體(GPCRs)結(jié)合后激活A(yù)C，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平迅速升高，PKA被激活并將UCR1中的絲氨酸殘基磷酸化，從而消除ERK的抑制作用。短式PDE4D缺少UCR1，卻反而被ERK的磷酸化活化，可能有其他調(diào)節(jié)成分參與。此外，ERK對(duì)超短式PDE4D活性沒有影響〔6〕。

1.4.2 PDE4D信號(hào)復(fù)合物 PDE4D能和某些蛋白如抑制蛋白(arrestin)結(jié)合而定位于細(xì)胞特定的區(qū)域內(nèi)。PDE4D及其錨定蛋白在細(xì)胞內(nèi)選擇性地表達(dá)來調(diào)控cAMP信號(hào)。Arrestin是信號(hào)支架蛋白，在許多GPCRs脫敏過程中起重要作用。目前已知 arrestin 有4 個(gè)成員:β－arrestin1、β－arrestin2 和兩個(gè)視覺 arrestin。PDE4D通過它們保守的催化區(qū)與β－arrestin形成穩(wěn)定的信號(hào)復(fù)合物。β腎上腺素受體(βAR)，βAR有兩種亞型:β1－AR和β2－AR。βAR與胞外信號(hào)結(jié)合后會(huì)產(chǎn)生兩條不同的信號(hào)通路:首先都是Gs介導(dǎo)的cAMP信號(hào)通路，Gs激活A(yù)C隨之產(chǎn)生cAMP。然后PKA使βAR磷酸化，β1－AR與PDE4D8形成信號(hào)復(fù)合物 β1－AR/PDE4D8，而 β2－AR 要與 β－arrestin 結(jié)合后才能與 PDE4D5 形成信號(hào)復(fù)合物 β2－AR/β－arrestin/PDE4D5〔1〕。另外，在恐懼條件下，β－arrestin－2會(huì)轉(zhuǎn)移到杏仁核胞膜處與PDE4D結(jié)合成β－arrestin－2/PDE4D復(fù)合物，進(jìn)而抑制了PKA的活性〔7〕。

2 咯利普蘭

咯利普蘭(roliplam)是1976年鑒定的第一個(gè)PDE4抑制劑，也是迄今為止最為常用的經(jīng)典PDE4抑制劑〔8〕。咯利普蘭是一種選擇性的PDE4抑制劑，能夠特異性抑制PDE4的活性，增加細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平，進(jìn)而激活多種蛋白磷酸化途徑，對(duì)中樞神經(jīng)功能、心血管功能、炎癥細(xì)胞/免疫系統(tǒng)、細(xì)胞黏附以及代謝過程都有影響。用咯利普蘭的短時(shí)(2 min)預(yù)處理引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)cAMP的上升，然而長(zhǎng)時(shí)(8 h)預(yù)處理會(huì)引起HUVEC cAMP的下降。用咯利普蘭長(zhǎng)時(shí)預(yù)處理誘導(dǎo)PDE4活性明顯增加。這一結(jié)果表明咯利普蘭對(duì)PDE4的抑制能誘導(dǎo)PDE4活性的增加，這可能作為促進(jìn)cAMP降解的代償機(jī)制〔9〕?？├仗m是作用于細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的新型抗炎藥物，但是PDE3和PDE5的抑制劑的共同處理能降低咯利普蘭的抗炎癥效應(yīng)〔10〕?？├仗m能抑制相關(guān)炎癥細(xì)胞的招募和激活，抑制由脂多糖(LPS)引起的炎癥因子的產(chǎn)生?？├仗m能增加大鼠細(xì)胞質(zhì)胰高血糖素樣肽1(GLP－1)的濃度，并且能夠增強(qiáng)葡萄糖誘導(dǎo)的 GLP－1 的釋放〔11〕。

3 缺血性腦卒中

腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)常見病和多發(fā)病，死亡率約占所有疾病的10%，是世界范圍內(nèi)的死亡和長(zhǎng)期致殘的三大原因之一〔12，13〕。腦卒中是癡呆和年齡相關(guān)的認(rèn)知下降的重要原因，還是晚發(fā)癲癇癥的主要原因〔14〕。大約50% ～70%的存活者遺留癱瘓、失語等嚴(yán)重殘疾。腦卒中包括缺血性腦卒中、出血性腦卒中、高血壓腦病和血管性癡呆，其中大約80%的腦卒中源于缺血性，大多數(shù)由動(dòng)脈硬化癥引起〔15〕。根據(jù)TOAST(the Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment)標(biāo)準(zhǔn)，缺血性腦卒中可以再細(xì)分成3個(gè)主要的種類:(1)大動(dòng)脈硬化癥，(2)心源性梗死，(3)梗死引起的小脈管閉塞〔12〕。環(huán)境和遺傳因素都有能引起缺血性腦卒中的危險(xiǎn)，一直以來，糖尿病、高血壓、心肌梗死以及抽煙史等被認(rèn)為是腦卒中的經(jīng)典危險(xiǎn)因素。然而，這些環(huán)境危險(xiǎn)因素的控制并沒有降低腦卒中的發(fā)病率〔16〕，是由于對(duì)這種疾病的易患病的體質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)知之甚少〔17〕。

4 PDE4D與缺血性腦卒中

2003年，冰島的 Gretarsdottir等〔18〕deCODE研究組成員發(fā)現(xiàn)，PDE4D基因的多態(tài)性增加了缺血性腦卒中的危險(xiǎn)性。他們?cè)诒鶏u人群中發(fā)現(xiàn)了與家族性缺血性腦血管病(ICVD)相關(guān)的基因:PDE4D基因與腦動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。該基因和以往認(rèn)識(shí)的與高血壓、糖尿病、血脂代謝異常、高膽固醇血癥等腦血管病危險(xiǎn)因素的相關(guān)基因不同，被認(rèn)為是21世紀(jì)首先、也是迄今唯一新發(fā)現(xiàn)的腦卒中候選基因〔12，19〕。他們發(fā)現(xiàn)PDE4D 單核苷酸多態(tài)性(SNP)89，SNP 87，SNP 83，SNP56，SNP45和SNP41等6個(gè)SNPs與缺血性腦卒中危險(xiǎn)密切相關(guān)。

此后，全球的腦血管病研究學(xué)者掀起了研究該基因的熱潮，但是難以達(dá)成共識(shí)。Staton等〔15〕在對(duì)澳大利亞人 PDE4D基因高度保守區(qū)進(jìn)行系統(tǒng)性多態(tài)性研究基礎(chǔ)上，對(duì)初次缺血性腦卒中患者PDE4D基因的6個(gè)SNP進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)PDE4D SNP 89，SNP 87，SNP 83 及 PDE4D 單模標(biāo)本89－87－83 與缺血性腦卒中有重大關(guān)聯(lián)，這和對(duì)冰島人的研究結(jié)果是一致的。但是沒有證明腦卒中與PDE4D SNP 56、SNP 45或SNP 41存在顯著的關(guān)聯(lián)。Kostulas等〔17〕對(duì)瑞典人的病例－對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中與SNP45關(guān)聯(lián)不大，但單模標(biāo)本SNP45－41與缺血性腦卒中密切相關(guān)。Kim等〔20〕挑選韓國(guó)患者PDE4DSNP41作為候選標(biāo)記，但是在病例和對(duì)照之間PDE4D SNP 41基因型的分布沒有發(fā)現(xiàn)重大的不同〔20〕。而 Song等〔2〕對(duì)美國(guó)人的病例－對(duì)照研究結(jié)果表明，在基因5′端的一個(gè)內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)的SNP rs918592與缺血性腦卒中的相關(guān)密切。Munshi等〔21〕對(duì)印度250個(gè)病人和250個(gè)健康人的病例－對(duì)照研究表明，SNP83與缺血性腦卒中關(guān)聯(lián)重大而SNP87關(guān)聯(lián)不大。對(duì)這些顯然相矛盾的結(jié)果最可能的解釋是，SNP檢測(cè)與缺血性腦卒中不是直接連鎖的，而是與原因等位基因不均一連鎖的，這在不同的人群中不同。此外，Liao等〔22〕對(duì)高雄醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2006年1月到2007年11月的腦卒中病人研究表明，PDE4D的遺傳效應(yīng)在男性中明顯而在女性中不明顯。這些結(jié)果表明對(duì)PDE4D基因還有待更進(jìn)一步的研究。

5 展望

缺血性腦卒中是世界范圍內(nèi)死亡和長(zhǎng)期殘疾的三大原因之一，給患者家庭造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。缺血性腦卒中危險(xiǎn)環(huán)境因素和遺傳因素的研究對(duì)其預(yù)防和治療起到一定的作用。缺血性腦卒中等位基因PDE4D的發(fā)現(xiàn)使缺血性腦卒中的預(yù)防與治療進(jìn)入了一個(gè)新紀(jì)元。PDE4抑制劑咯利普蘭引入到臨床更是對(duì)缺血性腦卒中治療達(dá)到了極好的效果。

PDE4D基因SNP的研究結(jié)果表明，缺血性腦卒中在不同的人群中的SNP定位是不同的。這就為缺血性腦卒中的預(yù)防與治療增加了相當(dāng)?shù)碾y度。因此，應(yīng)進(jìn)一步研究PDE4D在缺血性腦卒中的過程中的作用分子機(jī)制，以及不同的SNP定位的對(duì)缺血性腦卒中的影響，為臨床治療提供治療靶點(diǎn)。

1 Richter W，Day P，Agrawal R，et al.Signaling from β1－and β2－adrenergic receptors is defined by differential interactions with PDE4〔J〕.EMBO J，2008;27(2):384－93.

2 Song Q，Cole JW，O′Connell JR，et al.Phosphodiesterase 4D polymorphisms and the risk of cerebral infarction in a biracial population:the Stroke Prevention in Young Women Study〔J〕.Hum Mol Genet，2006;15(16):2468－78.

3 Richter W，Jin SL，and Conti M.Splice variants of the cyclic nucleotide phosphodiesterase PDE4D are differentially expressed and regulated in rat tissue〔J〕.Biochem J，2005;388:803－11.

4 Iancu RV，Jones SW，Harvey RD.Compartmentation of cAMP signaling in cardiac myocytes:a computational study〔J〕.Biophys J，2007;92(9):3317－31.

5 Worrall BB，Mychaleckyj JC.PDE4D and stroke:a real advance or a case of the Emperor′s new clothes〔J〕?Stroke，2006;37(8):1955－7.

6 孫超淵，張 莉，程克棣，等.磷酸二酯酶4研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006;22(10):1161－7.

7 Li YT，Li HH，Liu X，et al.Regulation of amygdalar PKA by β－arrestin－2/phosphodiesterase－4 complex is critical for fear conditioning〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2009;106(51):21918－23.

8 陳 艷，李子剛，湯慧芳，等.咯利普蘭對(duì)大鼠哮喘模型肺組織磷酸二酯酶及 IL－4 的影響〔J〕. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006;22(4):447－51.

9 Campos－Toimil M，Keravis T，Orallo F，et al.Short－term or long－term treatments with a phosphodiesterase－4(PDE4)inhibitor result in opposing agonist－induced Ca2+responses in endothelial cells〔J〕.Br J Pharmacol，2008;154(1):82－92.

10 Clayton RA，Dick C，Mackenzie A，et al.The effect of selective phosphodiesterase inhibitors，alone and in combination，on a murine model of allergic asthma〔J〕.Respir Res，2004;5:4－12.

11 Ong WK，Gribble FM，Reimann F，et al.The role of the PDE4D cAMP phosphodiesterase in the regulation of glucagon－like peptide－1 release〔J〕.Br J Pharmacol，2009;157(4):633－44.

12 Kuhlenb?umer G，Berger K，Huge A，et al.Evaluation of single nucleotide polymorphisms in the phosphodiesterase 4D gene(PDE4D)and their association with ischaemic stroke in a large German cohort〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2006;77(4):521－4.

13 Tang X，Hu YH，Chen DF，et al.The Fangshan/Family－based Ischemic Stroke Study In China(FISSIC)protocol〔J〕.BMC Med Genet，2007;8:60.

14 Markus HS.Unravelling the genetics of ischaemic stroke〔J〕.PLoS Med，2010;7(3):1000225－9.

15 Staton JM，Sayer MS，Hankey GJ，et al.Association between phosphodiesterase 4D gene and ischaemic stroke〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2006;77(9):1067－9.

16 張穎冬.2006年卒中遺傳學(xué)研究進(jìn)展〔J〕.Chin J Stroke，2007;2(2):136－9.

17 Kostulas K，Gretarsdottir S，Kostulas V，et al.PDE4D and ALOX5AP genetic variants and risk for Ischemic Cerebrovascular Disease in Sweden〔J〕.J Neurol Sci，2007;263(1－2):113－7.

18 Gretarsdottir S，Thorleifsson G，Reynisdottir ST，et al.The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke〔J〕.Nat Genet，2003;35(2):131－8.

19 徐淑蘭，張穎冬.磷酸二酯酶4D基因與缺血性腦血管病的研究進(jìn)展〔J〕. 中國(guó)腦血管病雜志，2008;5(3):139－42.

20 Kim MK，Kim JT，Choi SM，et al.Phosphodiesterase 4D gene and risk of noncardiogenic ischemic stroke in a Korean population〔J〕.J Korean Med Sci，2009;24(2):307－10.

21 Munshi A，Babu MS，Kaul S，et al.Phosphodiesterase 4D(PDE4D)gene variants and the risk of ischemic stroke in a South Indian population〔J〕.J Neurol Sci，2009;285(1－2):142－5.

22 Liao YC，Lin HF，Guo YC，et al.Sex－differential genetic effect of phosphodiesterase 4D(PDE4D)on carotid atherosclerosis〔J〕.BMC Med Genet，2010;11:93－101.