汪葉庭，劉斯婷，丁 凡，魏朔南

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710069)

秦艽(Gentiana macrophylla)為龍膽科(Gentianaceae)植物，其根是我國重要的傳統(tǒng)中藥材之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主寒熱邪氣，寒濕風(fēng)痹，肢節(jié)痛、下水、利小便。陜西和甘肅為秦艽藥材的地道產(chǎn)區(qū)［1］。秦艽化學(xué)成分分析結(jié)果表明其主要成分為裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類［2］，其中龍膽苦苷含量最高，具有保肝、利膽、抗炎的生物活性，其次是獐牙菜苦苷，具有助消化和鎮(zhèn)痛作用，二者都已成功開發(fā)出中藥新藥。前人對(duì)陜西秦艽的化學(xué)成分和HPLC指紋圖譜、秦艽藥材 HPLC 指紋圖譜進(jìn)行了研究［3－5］，但對(duì)于不同地方的秦艽以及藥材與藥源植物的HPLC指紋圖譜和龍膽苦苷的含量比較研究尚無報(bào)道。為此，我們采用HPLC指紋圖譜分析結(jié)合統(tǒng)計(jì)聚類分析，對(duì)陜西太白、隴縣所產(chǎn)秦艽藥原植物和西安市售秦艽藥材進(jìn)行了系統(tǒng)的比較分析，其結(jié)果可為深入開展秦艽化學(xué)成分與產(chǎn)地相關(guān)性以及秦艽地道藥材的特點(diǎn)，控制秦艽藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

秦艽藥原植物于2010年10月8日和11月4日分別采自陜西太白縣嘴頭鎮(zhèn)強(qiáng)里川村和陜西隴縣八渡鎮(zhèn)三年生人工栽培秦艽，各采集10株個(gè)體。秦艽藥材于2010年11月14日購于西安市藥材市場10個(gè)不同藥材商鋪，每個(gè)商鋪購200 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

日本島津LC－10ATvp高效液相色譜儀，Millipore純水器(Elix－3)，Millipore超純水器(Synergy)，小型高速粉碎機(jī)(ZN－02)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(WGL－45B)，高功率數(shù)控超聲波清洗器(KH－2000KHD)。

1.3 試劑

乙腈、甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)均為色譜純，水為超純水，龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所。

表1 秦艽藥源植物和藥材

1.4 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱(200 mm ×4.6 mm，5 um);流速:0.5 ml·min－1;柱溫:30℃;檢測波長:240 nm:進(jìn)樣量:20 uL。流動(dòng)相選擇乙腈(A)一水(B)，梯度洗脫程序0 min:97%B，7 min:92%B，12 min:88%B，15 min.85%B，18 min:88%B，50 min:stop。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱取龍膽苦苷對(duì)照品0.025 g，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，取溶液12.5mL，加甲醇于50 mL容量瓶中定容，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.6 樣品溶液制備

將采集的秦艽藥源植物根在100℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，粉碎(市購藥材直接粉碎)，精密稱取0.5 g樣品粉末，置于50 mL三角瓶中，加入約20 mL甲醇溶液，超聲波振蕩30 min，過濾。濾液用甲醇定容于50 mL容量瓶中，再取1 mL用甲醇溶液定容于10 mL容量瓶中，搖勻，0.22 um微孔濾膜過濾，即得。

1.7 HPLC相似度分析

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)，將色譜工作站數(shù)據(jù)輸入中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件進(jìn)行分析。

1.8 聚類分析

采用STATISTICA6.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，以歐氏距離為測度，對(duì)秦艽藥源植物的7個(gè)共有峰的峰面積和各峰面積占總峰面積的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 龍膽苦苷含量的測定

2.1.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算其龍膽苦苷峰面積的RSD=0.87%。

2.1.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品5份，按照“樣品溶液配制”項(xiàng)制備供試溶液，每份進(jìn)樣20 μL，計(jì)算其龍膽苦苷峰面積的RSD=0.72%。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試溶液分別放置0、3、6、9、12 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果表明龍膽苦苷峰面積無明顯變化(RSD=1.73%，)表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 回收率試驗(yàn) 精密稱取己知龍膽苦苷含量的樣品適量，定量加入對(duì)照品，制備供試溶液5份，測定龍膽苦苷含量，計(jì)算回收率。結(jié)果表明平均回收率為 100.5%，RSD=2.58%。

2.1.5 龍膽苦苷含量測定 運(yùn)用外標(biāo)法對(duì)秦艽藥源植物、秦艽藥材樣品的龍膽苦苷含量進(jìn)行測定，其色譜圖和分析結(jié)果見圖1和表2。

圖1 龍膽苦苷和秦艽樣品高效液相色譜圖

表2 秦艽樣品中龍膽苦苷含量

從表2可知，隴縣栽培秦艽龍膽苦苷含量為5.2% ～9.59%，平均含量為 7.73%，標(biāo)準(zhǔn)差為1.372%，太白栽培秦艽龍膽苦苷含量9.03% ～12.62%，平均含量為10.75%，標(biāo)準(zhǔn)差為1.110%，市售秦艽藥材龍膽苦苷含量為0.25% ～6.31%，平均含量為3.31%。

2.2 秦艽藥原植物及市售秦艽藥材HPLC指紋圖譜的測定

2.2.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別放置0、12、24、36、48 h 進(jìn)行指紋圖譜分析，其結(jié)果各特征峰表觀豐度無明顯差異。比較色譜峰保留時(shí)間，各色譜共有峰保留時(shí)間RSD在0.15% ～0.32%之間，計(jì)算相似度均大于0.995，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，比較各色譜峰的保留時(shí)間，結(jié)果表明5次進(jìn)樣各共有峰保留時(shí)間RSD在0.27% ～1.31%之間，計(jì)算相似度均大于0.996，表明供試品進(jìn)樣分析精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批秦艽藥材5份，按

2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，考察HPLC指紋圖譜各特征峰的表觀豐度，結(jié)果表明各共有峰保留時(shí)間RSD在0.06% ～2.54%之間，計(jì)算相似度均大于0.993，表明本法測定的重復(fù)性良好。

2.2.4 秦艽藥源植物HPLC指紋圖譜的建立 取1～20號(hào)樣品，按1.6項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在已確定的色譜條件下取樣品溶液20 μL進(jìn)樣，記錄50 min色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)進(jìn)行各樣品色譜圖指紋圖譜分析(見圖2)，確定了7個(gè)共有峰，7號(hào)峰龍膽苦苷的含量最高。

圖2 陜西秦艽藥源植物的HPLC指紋圖譜

2.2.5 市售秦艽藥材HPLC指紋圖譜的建立 對(duì)21～30號(hào)樣品進(jìn)行HPLC指紋圖譜測定，發(fā)現(xiàn)只有30號(hào)樣品(見圖2(C))各種峰出現(xiàn)的位置及相對(duì)峰面積與前20號(hào)樣品具有明顯差異。

2.2.6 相似度計(jì)算 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)，將色譜工作站數(shù)據(jù)輸入中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，以1號(hào)樣品為對(duì)照藥材，選定上述7個(gè)共有峰進(jìn)行譜峰匹配，通過中位數(shù)矢量計(jì)算得出秦艽樣品指紋圖譜的共有模式，并以此共有模式為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各批樣品的相似度其結(jié)果見表3。由表3可見，用于建立指紋圖譜的1－20秦艽藥原植物其相似度為0.997～1，平均相似度為0.998。用指紋圖譜適用性檢驗(yàn)的市售秦艽藥材21～29號(hào)樣品的相似度為0.911～0.999，平均相似度為0.982，而30號(hào)青海秦艽藥材的相似度為0.555。

表3 30批秦艽藥材的相似度

2.2.7 共有峰峰面積的差異 分別將不同產(chǎn)地秦艽藥原植物以及市售秦艽藥材HPLC 7個(gè)共有峰的峰面積變異系數(shù)計(jì)算列于表4、5、6。

表4 隴縣秦艽共有峰面積的變異系數(shù)

表5 太白秦艽共有峰面積的變異系數(shù)

由表4、5可見，兩個(gè)栽培地中20個(gè)樣品的7個(gè)共有峰的面積之間均存在差異。對(duì)于同一個(gè)生長地，隴縣栽培秦艽2號(hào)峰的面積在不同樣品之間差異最小，變異系數(shù)的為13.5%，3號(hào)峰的面積差異最大，變異系數(shù)的為48.1%，其余5個(gè)共有峰的面積變異系數(shù)由小到大依次是7號(hào)峰、6號(hào)峰、1號(hào)峰、5號(hào)峰和4號(hào)峰;太白栽培秦艽7號(hào)峰的面積在不同樣品之間差異最小，變異系數(shù)的為10.3%，1號(hào)峰的面積差異最大，變異系數(shù)的為84.7%，其余5個(gè)共有峰的面積變異系數(shù)由小到大依次是6號(hào)峰、2號(hào)峰、5號(hào)峰、4號(hào)峰和3號(hào)峰。由此可見，對(duì)于同一栽培地的秦艽藥原植物中不同個(gè)體之間同一個(gè)峰的峰面積除太白栽培秦艽中的1號(hào)峰和3號(hào)峰CV表現(xiàn)出較大的變化外，其余變異系數(shù)均在50%以內(nèi)，表明同一個(gè)栽培地秦艽藥原植物各共有峰峰面積差異不顯著。

因?yàn)樘浊剀?0株個(gè)體之間1號(hào)峰和3號(hào)峰的變異系數(shù)大于50%，表現(xiàn)出在同一生長地內(nèi)存在較大差異，故為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，只取2、4、5、6和7號(hào)峰5個(gè)共有峰與隴縣秦艽進(jìn)行不同生長地藥源植物之間的比較，其結(jié)果列于表6。

表6 藥源植物之間共有峰的變異系數(shù)

由表6結(jié)果可見，對(duì)于隴縣和太白兩個(gè)不同產(chǎn)地的藥源植物之間峰面積變異系數(shù)最大為5號(hào)峰CV為87.9%，其余變異系數(shù)均小于25%，表明太白和隴縣兩地的秦艽藥原植物化學(xué)成分的差異主要為5號(hào)峰。

取2、4、5、6和7號(hào)5個(gè)共有峰進(jìn)行藥源植物和藥材之間共有峰差異的比較，結(jié)果見表7。

表7 藥源植物與藥材之間共有峰的變異系數(shù)

由表7可見，市售秦艽藥材與秦艽藥原植物各共有峰面積變異分析結(jié)果顯示，6號(hào)峰的差異最小，變異系數(shù)的為46.2%，2號(hào)峰的差異最大，變異系數(shù)的為77.6%，其余3個(gè)共有峰的變異系數(shù)由小到大依次是4號(hào)峰、5號(hào)峰和7號(hào)峰。表明市售秦艽藥材與藥原植物各共有峰之間存在較大差異。

2.3 聚類分析

以1～20個(gè)樣品的7個(gè)共有峰的峰面積和各峰面積占總峰面積的百分?jǐn)?shù)為依據(jù)，采用STATISTICA6.0軟件，以歐氏距離為測度，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。由圖3可見當(dāng)L=740124.9時(shí)，所有20個(gè)樣本分別聚為兩組，隴縣栽培秦艽 1、2、3、4、6、7、8、10號(hào)樣本聚為一組，太白的11～20號(hào)樣本聚為另一組。特殊的是隴縣栽培秦艽5號(hào)和9號(hào)樣本也聚在這一組。

圖3 成分指紋圖譜聚類圖

3 討論

3.1 龍膽苦苷是秦艽中的主要有效成分，其含量的高低可用于衡量秦艽藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。由太白、隴縣藥原植物及市售秦艽藥材的龍膽苦苷含量分析結(jié)果顯示，龍膽苦苷含量最高是太白栽培秦艽，其次是隴縣栽培秦艽，表明陜西太白、隴縣是秦艽的地道產(chǎn)區(qū)，而太白更適合于秦艽的生長和栽培。市售秦艽藥材龍膽含量遠(yuǎn)低于太白和隴縣秦艽藥原植物，推斷其原因我們認(rèn)為:龍膽苦苷為裂環(huán)烯醚萜類化合物，該類化合物化學(xué)性質(zhì)活潑，不穩(wěn)定，易被植物中的酶分解［6］。隨著秦艽藥材貯存時(shí)間的延長這種酶分解結(jié)果將逐漸累積，最終可能導(dǎo)致龍膽苦苷含量下降，使得市售秦艽藥材與秦艽藥原植物之間含量差異。由此反映出秦艽藥材應(yīng)該愈新鮮愈好。

3.2 中醫(yī)藥理論與實(shí)踐的非線性特點(diǎn)要求綜合評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，色譜指紋圖譜(圖像)分析是對(duì)中藥及其制劑進(jìn)行綜合宏觀分析的可行性手段之一［7，8］，能夠較全面地反映藥材的成分及特征。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)秦艽地道產(chǎn)區(qū)陜西太白縣和隴縣秦艽藥原植物的高效液相色譜指紋圖譜分析，建立陜西秦艽藥原植物指紋圖譜，并以建立的指紋圖譜比較分析了西安藥材市場的市售秦艽藥材，結(jié)果表明，本HPLC指紋圖譜分析方法，不僅可以區(qū)分和鑒別秦艽藥材的真?zhèn)?，而且還可以判斷秦艽藥材的質(zhì)量好壞，可以作為秦艽質(zhì)量控制的方法。

3.3 石張燕等人對(duì)陜西產(chǎn)秦艽質(zhì)量變異與遺傳多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)陜西省不同產(chǎn)區(qū)秦艽藥材的質(zhì)量具有一定的差異［9］。吳迪等人對(duì)西部地區(qū)瀕危藥用植物秦艽的質(zhì)量進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)秦艽藥材的龍膽苦苷含量具有較大差異［10］。吳玉泓等人對(duì)不同產(chǎn)地秦艽的質(zhì)量和遺傳多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)龍膽苦苷的含量有一定的差異［11］。本文研究結(jié)果顯示，兩個(gè)不同生長地秦艽藥原植物根中無論是龍膽苦苷含量還是其他化合物含量之間均存在差異，差異最大的為5號(hào)峰，其次為7號(hào)峰龍膽苦苷，與文獻(xiàn)報(bào)道相同。依據(jù)這些差異變化，采用聚類分析可以鑒別隴縣和太白兩地的秦艽藥原植物，判斷秦艽藥原植物的產(chǎn)地來源。

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