董雅潔 高維娟 (承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000)

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，受多種基因精確調(diào)控的主動的、程序化的死亡過程，是機體重要的自穩(wěn)調(diào)節(jié)機制〔1〕。近年來通過大量實驗研究表明，線粒體通路在細(xì)胞存亡機制中起著至關(guān)重要的作用，而在眾多的凋亡調(diào)控基因中，bcl-2蛋白家族和胱天蛋白酶(caspase)家族目前最受關(guān)注，其中bcl-2基因和bax基因是目前已知的在凋亡調(diào)控過程中功能相互對立的一對最重要的調(diào)控基因，caspase-3是凋亡過程中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，三者在細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)系已成為凋亡研究中的熱點問題，本文將就此做一綜述。

1 bcl-2蛋白與細(xì)胞凋亡

1.1 bcl-2蛋白家族的分類、結(jié)構(gòu)與功能 bcl-2是B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia 2，bcl-2)的縮寫，與秀麗隱桿線蟲的生存基因Ced-9有高度同源性，是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的凋亡調(diào)節(jié)因子。目前已發(fā)現(xiàn)有20余種bcl-2蛋白家族成員，這一多基因家族均由決定蛋白亞細(xì)胞定位的羧基端疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和數(shù)量不等的bcl-2同源結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成。根據(jù)其功能和結(jié)構(gòu)的不同可將bcl-2基因家族分為三類：第一類是 bcl-2 亞家族，包括：bcl-2、bcl-xl、bcl-w、Mcl-l、bfl-1/A1和bcl-G等，它們一般均同時含有BH1～BH4四個同源結(jié)構(gòu)域，其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域，決定著抑制細(xì)胞凋亡功能的存在〔2〕;第二類是Bax亞家族，包括：bax、bak等，其結(jié)構(gòu)中一般都含有BH1、BH2和BH3三個結(jié)構(gòu)域，可促進細(xì)胞的凋亡;第三類是促細(xì)胞凋亡蛋白中的特殊成員BH3亞家族，包括 bad、bid、bim、bik、Puma和 Noxa等，此亞家族最顯著的特點是僅含有一個BH3結(jié)構(gòu)域，BH3結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡所必需的致死性結(jié)構(gòu)域，起促凋亡活性的發(fā)揮至關(guān)重要〔3〕。

1.1.1 bcl-2的結(jié)構(gòu)及功能 抗凋亡基因代表成員bcl-2是第一個被確認(rèn)的能對抗細(xì)胞凋亡的基因，與Ced-9基因同源性為23%，由239個氨基酸殘基所構(gòu)成，定位于18號染色體21區(qū)，含3個外顯子和2個內(nèi)含子，可編碼26 kD的bcl-2α和22 kD的bcl-2β兩種蛋白，其中bcl-2α是抑制凋亡作用發(fā)揮的主要蛋白，為線粒體膜的整合蛋白〔4〕。三維結(jié)構(gòu)研究顯示，bcl-2是由位于中心的兩個長疏水性α-螺旋(α5和α6)包繞著外周五個親水性兩性α-螺旋構(gòu)成的七螺旋拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。在其肽鏈的C末端具有由19個疏水性氨基酸片段組成的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，可通過該疏水區(qū)錨定于線粒體外膜、外核膜及部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面，是阻止凋亡早期征象發(fā)生的重要區(qū)域〔5〕。

1.1.2 bax的結(jié)構(gòu)及功能 bax作為促凋亡代表成員位于19q13.3～q13.4區(qū)，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，能夠編碼α、β、γ、δ、ε和σ6種bax蛋白亞型。多項實驗證明，bax基因編碼的具有生物學(xué)活性的baxα由192個氨基酸組成，分子量為21 kD，是bax基因在細(xì)胞中發(fā)揮促凋亡作用的主要表達形式。蛋白質(zhì)序列分析顯示，baxα蛋白其21%的氨基酸與bcl-2具有同源性，且集中在C端的保守區(qū)。

1.2 bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控機制

1.2.1 bcl-2在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控機制 定位于線粒體外膜上的bcl-2至少在三個水平上發(fā)揮凋亡抑制作用：(1)通過抑制谷胱甘肽的外泄、降低/對抗線粒體巰基的氧化還原狀態(tài)以控制其膜電位從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生;(2)通過介導(dǎo)線粒體外膜通透轉(zhuǎn)運孔(PT)孔道復(fù)合體的開放，抑制細(xì)胞色素c(cyt-c)和凋亡誘導(dǎo)因子AIF等促凋亡蛋白的釋放阻止凋亡的進程;(3)通過與胱冬肽酶的間接作用，將凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1定位至線粒體膜，通過對其結(jié)構(gòu)的調(diào)控阻斷凋亡蛋白酶的激活，組織cty-c作用的發(fā)揮，使細(xì)胞免于死亡〔6〕。

定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的bcl-2抗細(xì)胞凋亡作用的發(fā)揮主要與胞內(nèi)的Ca2+濃度高低有關(guān)〔7〕。在凋亡的早期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+持續(xù)釋放，導(dǎo)致胞質(zhì)中的Ca2+濃度持續(xù)增高可充當(dāng)?shù)蛲龅膯有盘栆l(fā)細(xì)胞凋亡〔8〕。Ling等〔9〕發(fā)現(xiàn)，高表達的 bcl-2可明顯抑制K+引起的Ca2+濃度升高，且這種抑制作用在加入bcl-2抑制劑后消失。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法發(fā)現(xiàn)，bcl-2高表達可抑制Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)中的跨膜流動，使Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶活性降低，胞質(zhì)中Ca2+濃度處于穩(wěn)定水平，從而抑制細(xì)胞凋亡。

1.2.2 bax在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控機制 bax蛋白多以非活性單體形式分布于胞質(zhì)中，只有在接收到凋亡信號刺激被激活后，發(fā)生分子構(gòu)想改變，移位并插入線粒體外膜后形成bax大孔道，破壞線粒體膜的完整性，并于bcl-2等抑制凋亡的蛋白對抗，阻止其抗凋亡作用的發(fā)揮〔10〕。

1.2.3 bcl-2、bax蛋白間的相互作用關(guān)系 高分辨三維結(jié)構(gòu)研究顯示，bcl-2、bax蛋白中的BH1和BH2兩個同源結(jié)構(gòu)域可形成一疏水凹槽，分別與其N端的α-螺旋(bcl-2為BH3、BH4螺旋，bax僅有BH3螺旋片段)通過靜電和疏水作用結(jié)合形成同源二聚體;而易位至線粒體外膜上的促凋亡蛋白bax表面暴露的BH3螺旋可與抗凋亡的bcl-2蛋白表面的疏水凹槽結(jié)合，形成異源二聚體〔11〕。特定的蛋白二聚體對細(xì)胞凋亡進程產(chǎn)生不同的影響，這是bcl-2蛋白家族在細(xì)胞死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控過程中所特有的重要特征，是凋亡“主開關(guān)”作用發(fā)揮的重要結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，通常情況下bcl-2和bax兩種蛋白的表達量相對穩(wěn)定，而當(dāng)bax在細(xì)胞內(nèi)超表達時，bax/bax同源二聚體的數(shù)量明顯增多，細(xì)胞對死亡信號的反應(yīng)性增強，啟動凋亡;而當(dāng)bcl-2高表達時，則bax/bax二聚體大量解離，生成更為穩(wěn)定的bcl-2/bax異源二聚體，對抗其誘導(dǎo)凋亡的作用，使細(xì)胞存活期延長〔12〕。因此，多項研究〔13，14〕認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)這兩種對立蛋白間的比率關(guān)系是決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵。

2 caspase蛋白與細(xì)胞凋亡

2.1 caspase蛋白家族的分類、結(jié)構(gòu)與功能 caspase是一類存在于胞質(zhì)中的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，與線蟲的自殺基因CED-3同源，在細(xì)胞凋亡的過程中起著極其關(guān)鍵性作用〔15〕。迄今在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)該蛋白家族有14個性質(zhì)不同的成員，按發(fā)現(xiàn)的順序依次命名為caspase-1至caspase-14，其中至少有8個與細(xì)胞凋亡有關(guān)〔16〕。

根據(jù)在細(xì)胞凋亡過程中的結(jié)構(gòu)和功能可將caspase蛋白酶分為三大類：第一類是炎癥有關(guān)亞類，包括 caspase-l、4、5、13、14及小鼠caspase-11、12，主要參與促炎因子的成熟，在細(xì)胞凋亡進程中起輔助作用;第二類是凋亡啟動亞類：包括caspase-2、8、9、10，這一亞類蛋白酶位于級聯(lián)反應(yīng)上游，在結(jié)構(gòu)上一般都具有較長的原結(jié)構(gòu)域，能參與啟動下游的caspase蛋白酶〔17〕;第三類是凋亡效應(yīng)亞類：包括caspase-3、6、7，位于級聯(lián)反應(yīng)下游，一般分子相對較小，缺少蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，執(zhí)行剪切細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的作用，直接使細(xì)胞發(fā)生凋亡〔18〕。

caspase家族成員具有以下共同特點：①每個成員在催化位點上均含有一個特異性的五肽序列QACXG;②在胞漿內(nèi)均以相對分子量為30～50 kD的無活性的酶原形式存在，一個N端前域(prodomain)及一個由大小兩個亞基構(gòu)成的C端酶作用域;③酶活性依賴于半胱氨酸殘基的親核性;④對在底物N-末端裂解位點上的天門冬氨酸具有高度的特異性;⑤經(jīng)蛋白水解激活后大小亞基解離重組形成異四聚體活性形式。⑥caspase可自我活化并能相互激活，凋亡過程一旦觸發(fā)，即以聯(lián)級放大的方式進行;⑦正常情況下細(xì)胞內(nèi)caspase總是與其抑制劑共存，以免caspase酶原被意外激活而對正常細(xì)胞造成損傷。

2.2 caspase-3在細(xì)胞凋亡中的作用機制 凋亡發(fā)生是一個由caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程，即caspases在凋亡誘導(dǎo)信號的作用下，啟動型caspases先通過結(jié)合特異輔因子而激活，發(fā)揮水解蛋白的作用，從而激活下游效應(yīng)型caspases，一旦效應(yīng)caspase被激活，便大范圍的水解細(xì)胞內(nèi)的靶物質(zhì)，從而降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，最終使細(xì)胞不可逆的走向死亡〔19〕。caspase-3是ICE(白細(xì)胞介素1-β轉(zhuǎn)化酶)家族成員之一，又稱為半胱氨酸蛋白酶32(CPP32)，與Ced-3同源性最高，是主要的效應(yīng)caspase，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，在細(xì)胞凋亡過程中占據(jù)核心地位，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”〔20〕。其主要受粒酶 B、caspase-l、caspase-2、caspase-10、CPP32 激活蛋白酶(CAP)以及自身等所活化，活化后的caspase-3酶解切割DNA-PK(DNA依賴的蛋白激酶)和PARP(聚腺苷二磷酸核糖多聚酶)等，從而影響DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和損傷修復(fù)〔21〕。

3 bcl-2、bax和caspase-3在細(xì)胞凋亡中的相互關(guān)系

細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展可以概括為凋亡誘導(dǎo)、調(diào)控執(zhí)行和效應(yīng)三個階段，現(xiàn)已證明至少有線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑三條通路參與凋亡的發(fā)生〔22〕。其中線粒體依賴途徑是主要的傳導(dǎo)途徑，JNK通路是主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，cyt-c是線粒體電子電子傳遞鏈上的一個重要組成部分，其從線粒體釋放是凋亡啟動的關(guān)鍵步驟〔23〕。caspase-3作為caspase級聯(lián)反應(yīng)下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者，其激活在很大程度上依賴于cyt-c的釋放，而bcl-2家族中的bcl-2、bax基因是目前已知的細(xì)胞凋亡中最重要的調(diào)控基因，可通過線粒體途徑介導(dǎo)cyt-c等物質(zhì)釋放。隨著近年來關(guān)于bcl-2、bax和caspase-3在細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)過程中關(guān)系研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)bcl-2、bax不但可作為caspase-3的上游調(diào)控機制，參與對 caspase-3活性的調(diào)節(jié)〔24〕，還可作為 caspase-3的直接底物作用于 caspase-3的下游，二者在細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)過程中既相互聯(lián)系又相互制約。

3.1 bcl-2、bax可作為caspase-3的上游調(diào)控機制 bcl-2、bax蛋白位于線粒體上游，是線粒體膜的通透性改變的重要調(diào)控因素〔25〕，其過度表達能控制cyt-c的釋放和下游caspase-3蛋白酶的活化，介導(dǎo)細(xì)胞的存活或死亡〔26〕。bax在死亡信號刺激下可轉(zhuǎn)位至線粒體膜上，形成同源二聚體或多聚體，并在線粒體膜上形成通透性PT孔道，破壞膜內(nèi)離子及蛋白濃度差，釋放出cyt-c等促凋亡因子〔27〕。在dATP存在下cyt-c通過半胱氨酸蛋白酶作用域與Apaf-1結(jié)合形成凋亡體，并招募procaspase-9在其上寡聚〔28〕，進而激活 caspase-3，啟動 caspase 級聯(lián)反應(yīng)〔29〕。超表達的bcl-2蛋白一方面可與bax形成異源二聚體，抑制bax的轉(zhuǎn)位及二聚體化，關(guān)閉PT孔道，通過阻斷cyt-c的釋放，抑制下游caspase-3的激活，而有效地抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔30〕。另一方面，bcl-2還能與 Apaf-1結(jié)合并抑制其功能，阻止 procaspase-9活化實現(xiàn)抗凋亡的效應(yīng)〔11〕。此外，有研究發(fā)現(xiàn)bcl-2的過度表達可引起細(xì)胞核谷胱甘肽積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，阻止胞內(nèi)Ca2+流動，抑制線粒體膜釋放cyt-c，從而抑制caspase-3的活化，阻斷凋亡進程。

3.2 caspase-3可作為bcl-2的上游調(diào)控機制 bcl-2可作為caspase-3的直接作用底物，bcl-2蛋白的N端可變環(huán)區(qū)可被caspase-3在Asp34處剪切，裂解為具有類bax促凋亡活性功能的片段，加速凋亡進程。這一步驟被證明是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最關(guān)鍵限速步驟之一〔31〕。Kirsch等〔31〕用細(xì)胞凋亡提取物誘發(fā)細(xì)胞凋亡時，可見bcl-2的剪切片段。在對提取物進行caspase-3免疫清除后，bcl-2則不被剪切。當(dāng)用stau-rosporine(一種癌基因抑活藥)誘導(dǎo)缺乏caspase-3表達的MCF-7細(xì)胞凋亡時，bcl-2也不被剪切，由此說明caspase-3是bcl-2的生理性酶解蛋白酶，可構(gòu)成陽性凋亡反饋通路。

4 結(jié)語

大量研究顯示，bcl-2家族和caspase家族在細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尤其是線粒體途徑中發(fā)揮了極為重要的調(diào)控作用。然而，對bcl-2、bax和caspase-3蛋白的認(rèn)識還有待更進一步深入，目前，有關(guān)于caspase-3抑制劑、bcl-2及bax的激動劑和拮抗劑的研究也日益受到關(guān)注，這將有助于進一步明確二者在在細(xì)胞凋亡過程中的相互關(guān)系，揭示細(xì)胞凋亡的復(fù)雜的分子機制，并可能為凋亡相關(guān)疾病的治療提供新的作用靶點，為設(shè)計出更有效的治療手段提供重要的理論依據(jù)。

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