劉擁海,俞 樂(lè),崔鐵成

(肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

結(jié)縷草基因遺傳轉(zhuǎn)化研究的相關(guān)進(jìn)展

劉擁海,俞 樂(lè),崔鐵成

(肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

結(jié)縷草（Zoysia spp．）主要分布在東亞，它是當(dāng)前廣泛應(yīng)用的有眾多優(yōu)良特性的暖季型草坪草．綜述了結(jié)縷草植株再生體系的高效建立方法、抗性基因遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因結(jié)縷草對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響，旨在為通過(guò)生物技術(shù)手段引入相關(guān)抗性基因增強(qiáng)結(jié)縷草的抗逆性及延長(zhǎng)綠期等提供參考．

結(jié)縷草；遺傳轉(zhuǎn)化；綠期；抗寒性

結(jié)縷草（Zoysia spp．）是禾本科結(jié)縷草屬多年生暖季型草坪草，主要分布在亞洲．我國(guó)結(jié)縷草資源居世界首位．據(jù)有關(guān)資料顯示[1]，結(jié)縷草共有5個(gè)種廣泛用于草坪草生產(chǎn)開(kāi)發(fā)和種質(zhì)應(yīng)用，它們分別是日本結(jié)縷草(Z．japonica Steud．)、細(xì)葉結(jié)縷草(Z．tenuifolia Willd．)、溝葉結(jié)縷草（Z．Matrella Merr．）、中華結(jié)縷草(Z．sinica Hance)和大穗結(jié)縷草(Z．macrostachya Franch．＆ Sav．)．而在結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化研究中，以日本結(jié)縷草為受體材料最為常見(jiàn)．

華南地區(qū)地處水熱條件十分優(yōu)越的南亞熱帶，具有發(fā)展常綠型草坪的良好條件．結(jié)縷草具有耐干旱、耐鹽、耐踐踏、耐瘠薄、耐低修剪、彈性高等眾多的優(yōu)良特性，是目前廣泛應(yīng)用的暖季型草坪草種之一．不同種質(zhì)的結(jié)縷草，因遺傳背景不同其抗寒性差異明顯，部分結(jié)縷草種仍存在抗寒能力等方面的不足，低溫條件下綠期短是它的致命缺點(diǎn)[2]，因此，提高暖季型草坪草的抗寒力是目前南方草坪業(yè)及高爾夫草坪事業(yè)發(fā)展面臨的一大難題．海南地區(qū)的結(jié)縷草即使在冬季也能夠保持常綠，這與該地區(qū)冬季氣溫較高有關(guān)，由此表明溫度可能是影響結(jié)縷草綠期長(zhǎng)短的一個(gè)重要因素，所以通過(guò)導(dǎo)入外源基因提高結(jié)縷草的抗低溫能力，將對(duì)綠期延長(zhǎng)有重要作用[3]．

1 結(jié)縷草植株再生體系的高效建立方法

基因的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可在基因水平上精確地定向改造植物遺傳性狀，提高育種的目的性和可操作性，打破物種之間的生殖隔離障礙．將外源抗寒、抗旱、耐鹽堿、抗病蟲等基因引進(jìn)結(jié)縷草等廣泛栽培的草坪草中，在目前和今后相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)是科研人員最重要的工作目標(biāo)之一[4]．

大量研究資料表明，正確選擇外植體是建立結(jié)縷草高效再生體系成功的關(guān)鍵．目前在結(jié)縷草植株再生體系的相關(guān)研究中，外植體可選擇莖尖、幼穗、幼胚、花序、匍匐莖節(jié)段或成熟的種子等．Yoon和Kin[5]對(duì)以結(jié)縷草莖尖為外植體成功建立植株再生體系進(jìn)行了報(bào)道，并分析了2,4－D、BA對(duì)愈傷誘導(dǎo)及再生芽形成的影響；玄松南等[6]以幼穗、莖尖為外植體，成功建立了日本結(jié)縷草再生體系；Noh等[7]以不同發(fā)育階段結(jié)縷草的幼胚為外植體，從體胚發(fā)生途徑獲得了再生植株；Poeaim等[8]的研究表明，以結(jié)縷草的未成熟花序?yàn)橥庵搀w，可順利建立其植株再生體系；Inokuma等[9]以匍匐莖莖節(jié)為外植體建立了日本結(jié)縷草的懸浮培養(yǎng)體系．通常以幼穗、幼胚、匍匐莖等外植體來(lái)誘導(dǎo)結(jié)縷草胚性愈傷和建立再生體系，往往不需要繼代擴(kuò)增也容易得到大量相同基因型的愈傷組織．不過(guò)幼穗、幼胚、匍匐莖等外植體取材易受季節(jié)和時(shí)間的限制，且不宜消毒，因此往往難以獲得合適的幼穗或幼胚等外植體[10]．成熟胚具有取材方便、消毒容易、愈傷組織誘導(dǎo)率高等優(yōu)勢(shì)，因此到目前為止，結(jié)縷草基因遺傳轉(zhuǎn)化的外植體仍以成熟胚為主[11－13]．大量研究資料顯示[11－14]，在用成熟胚為外植體誘導(dǎo)愈傷形成過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種類型的愈傷形態(tài)，大部分為缺少2次生長(zhǎng)能力的非胚性愈傷，因此一般都需選用胚性愈傷組織，或胚性細(xì)胞懸浮系及其原生質(zhì)體來(lái)分化得到再生植株．劉擁海等[14]在前人研究基礎(chǔ)上，已建立一套簡(jiǎn)易且高效的結(jié)縷草愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生體系．

2 結(jié)縷草基因遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法

在目前結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化研究中，基因槍法和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是2種得到廣泛應(yīng)用的植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)．這2種方法各有優(yōu)勢(shì)和不足，基因槍法的最大優(yōu)勢(shì)是基因的轉(zhuǎn)化受體材料不受限制，目前在單、雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化中得到廣泛應(yīng)用．雖然基因槍法已成功應(yīng)用于多種冷季型或暖季型草坪草的遺傳轉(zhuǎn)化中，不過(guò)利用該法成功轉(zhuǎn)化結(jié)縷草并獲得轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)告尚不多見(jiàn)[15]．農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以其較高的轉(zhuǎn)化頻率、較低的外源基因插入拷貝數(shù)、較好的遺傳穩(wěn)定性、簡(jiǎn)單的操作及便宜的設(shè)備等優(yōu)勢(shì)超越基因槍法[16]．研究資料表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法不僅成功地應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，而且近年來(lái)通過(guò)深入研究農(nóng)桿菌侵染機(jī)理及改進(jìn)侵染技術(shù)，在7個(gè)科20多種單子葉植物（包括禾本科植物）中應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化外源基因獲得成功，因此有效克服了農(nóng)桿菌的宿主限制[17－18]．近10年來(lái)該方法已成功引入到結(jié)縷草基因遺傳轉(zhuǎn)化中．Chai和Kim[19]應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，成功將一些報(bào)告基因或抗除草劑基因?qū)胗扇毡窘Y(jié)縷草成熟胚誘導(dǎo)的胚性愈傷組織中，得到了再生植株，這也是世界上首次成功應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得結(jié)縷草轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)道．隨后，Rahman等[20]報(bào)道了應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法建立的日本結(jié)縷草高效轉(zhuǎn)化體系，由此農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化中得到廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的草業(yè)科學(xué)工作者應(yīng)用該技術(shù)培育出高抗逆性及綠色期延長(zhǎng)的結(jié)縷草新品系(種)．

3 結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化的外源基因選擇

早期的草坪草轉(zhuǎn)基因研究，除在匍匐翦股穎上較多引入抗除草劑基因及廣譜抗真菌的殼多糖酶基因外，結(jié)縷草等其他多數(shù)草坪草的引入主要為選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因．Inocuma等[9]報(bào)道了通過(guò)聚乙二醇介導(dǎo)法，將一些抗除草劑基因及報(bào)告基因?qū)肴毡窘Y(jié)縷草，成功獲得了最早的轉(zhuǎn)基因結(jié)縷草植株；隨后，Chai和Kim[19]以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化hpt和gus基因，得到結(jié)縷草再生植株并觀測(cè)到gus基因的表達(dá)；Ge等[21]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，首次通過(guò)直接侵染結(jié)縷草匍匐莖節(jié)點(diǎn)，成功獲得了轉(zhuǎn)hph和gus基因的植株．近年來(lái)，研究者們開(kāi)始重視引入有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因，轉(zhuǎn)化的目標(biāo)主要是為了提高結(jié)縷草的抗逆性和延長(zhǎng)綠期．Toyama等[22]以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)bar基因的轉(zhuǎn)化，獲得抗除草劑雙丙氨膦的日本結(jié)縷草轉(zhuǎn)基因植株；齊春輝等[23]獲得了轉(zhuǎn)入DREBIA基因的日本結(jié)縷草植株．章家長(zhǎng)等[24]報(bào)道了將擬南芥ipt基因?qū)虢Y(jié)縷草胚性愈傷組織中，成功得到了延緩衰老、綠期延長(zhǎng)的結(jié)縷草轉(zhuǎn)基因植株；而Li等[25]將擬南芥的CBF1基因?qū)胫腥A結(jié)縷草中，得到的轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性比野生型植株有較大提高，衰老速率得到明顯延緩．葉綠體是高等植物細(xì)胞重要的光合場(chǎng)所，葉綠體DNA中含有不少參與光合作用的重要基因，草業(yè)科學(xué)家希望通過(guò)調(diào)控葉綠體相關(guān)光合基因的表達(dá)改善其光合性能，培育出四季常綠的結(jié)縷草新品種．核酮糖－1,5－二磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose 1,5－bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco,EC 4.1.1.39)是大量存在于葉綠體中的一種蛋白質(zhì)，也是光合作用的關(guān)鍵酶之一，該酶蛋白含大、小2種不同亞基，其中大亞基由葉綠體DNA負(fù)責(zé)編碼．日本科學(xué)家[26]的研究表明，含Rubisco啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因日本結(jié)縷草植株，若對(duì)葉片給予光照即能誘導(dǎo)Rubisco基因的表達(dá)．通過(guò)有效調(diào)控Rubisco基因表達(dá)目的手段而延緩結(jié)縷草的衰老，將是人們期望實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)之一．此外，對(duì)于光合作用的另一個(gè)關(guān)鍵酶——編碼磷酸烯醇丙醇酸羧基激酶，科學(xué)家們將其基因成功導(dǎo)入日本結(jié)縷草后，得到的轉(zhuǎn)基因植株可顯著提高光合性能，即使在冬季也可使植株保持常綠[27]．

在外源基因轉(zhuǎn)化方面，結(jié)縷草等暖季型草坪草與冷季型草坪草相比發(fā)展較為遲緩，后者可以說(shuō)已進(jìn)入了轉(zhuǎn)抗性基因時(shí)代．Hu等[28]的研究表明，將玉米Ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ipt基因成功導(dǎo)入高羊茅中，得到轉(zhuǎn)基因植株的耐寒能力明顯提高，冬季綠期天數(shù)顯著增加．Hisano等[29]的研究表明，將小麥果聚糖轉(zhuǎn)移酶基因成功轉(zhuǎn)化黑麥草，獲得的轉(zhuǎn)基因植株可積累高含量的果聚糖，植株耐寒力得到明顯增強(qiáng)．McKersie等[30]應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將煙草的超氧化物歧化酶cDNA序列轉(zhuǎn)化苜蓿后，得到的轉(zhuǎn)基因植株抗凍能力及抗除草劑能力均大大提高．Aswath等[31]在匍匐翦股穎上引入了明顯提高抗干旱和耐鹽性的脅迫誘導(dǎo)基因．此外，Ye等[32]在黑麥草上引入了抗蟲基因．Salehi等[33]將細(xì)菌中編碼內(nèi)毒素因子的cry1Ac基因成功導(dǎo)入百慕大草坪草，得到的轉(zhuǎn)基因植株能有效抵抗黑毛蟲的危害．Fu等[34]報(bào)道了將水稻的TLPD34基因?qū)胭橘媵骞煞f，可以提高其對(duì)硬幣元狀斑病及褐斑病的免疫能力．Guo等[35]的研究結(jié)果表明，將擬南芥受體蛋白激酶PR5K基因?qū)胭橘媵骞煞f，得到的轉(zhuǎn)基因植株可以有效抵抗硬幣元狀斑病害．Green等[36]將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胭橘媵骞煞f愈傷組織,獲得了轉(zhuǎn)基因植物，并篩選出2個(gè)株系，這2個(gè)株系對(duì)紋枯病（Rhizoctonia solani）的抗性明顯高于其親本．綜上所述，在冷季型草坪草的基因遺傳轉(zhuǎn)化研究中，選擇轉(zhuǎn)化的外源基因較多，既有抗寒、抗凍、抗旱等非生物逆境的基因，又有抗病、抗蟲等抗生物逆境的基因，并已取得了較好的成效；因此，作為暖季型草坪草的重要代表結(jié)縷草，其基因遺傳轉(zhuǎn)化研究仍有較大的發(fā)展空間．

4 轉(zhuǎn)基因結(jié)縷草的生態(tài)安全性考量

相對(duì)于野生型結(jié)縷草品種，轉(zhuǎn)基因結(jié)縷草一般具有高抗逆性和綠期延長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，勢(shì)必將更多被引入到諸如運(yùn)動(dòng)草坪、高爾夫球場(chǎng)及庭院綠化等環(huán)境中．不過(guò)人們擔(dān)心一旦轉(zhuǎn)基因結(jié)縷草大規(guī)模向大田釋放可能會(huì)產(chǎn)生生態(tài)安全問(wèn)題．歸納起來(lái)，擔(dān)心的問(wèn)題主要有2個(gè)[37]：一是認(rèn)為轉(zhuǎn)基因結(jié)縷草中的外源基因可能隨著花粉釋放時(shí)與野生雜草雜交，進(jìn)而發(fā)生基因漂移，使雜草獲得超強(qiáng)的抗逆能力，從而產(chǎn)生潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)；二是擔(dān)心已導(dǎo)入抗性基因的轉(zhuǎn)基因結(jié)縷草比野生型草種具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)能力，勢(shì)必會(huì)侵占野生草種的生存環(huán)境，從而破壞生物多樣性．不過(guò)，相關(guān)研究資料表明這種擔(dān)心可能是多余的．最近Bae等[38]的研究結(jié)果表明，從實(shí)驗(yàn)室得到的轉(zhuǎn)基因日本結(jié)縷草釋放到大田栽培并不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)．他們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因結(jié)縷草抗除草劑基因并未在臨近的雜草中檢測(cè)到，雖然在野生型結(jié)縷草中檢測(cè)到該基因，但平均僅為6%，并且相距越遠(yuǎn)，基因漂移的影響越小，當(dāng)距離超過(guò)3 m就檢測(cè)不到影響了．此外，在其他的轉(zhuǎn)基因作物中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果．Celis等[39]的研究表明，種植在安第斯山脈的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，僅僅與種在附近的野生型馬鈴薯有交流，對(duì)周邊其他物種植物基本無(wú)影響．路興波等[40]的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米外源基因漂移僅在種內(nèi)發(fā)生，并且漂移程度與花粉漂移的頻率和距離呈現(xiàn)正相關(guān)，在不同物種間基因飄移的可能性非常小．從以上研究資料可以看出，只要對(duì)轉(zhuǎn)基因結(jié)縷草的生長(zhǎng)環(huán)境管理得當(dāng)，對(duì)基因飄移是可以有效控制的．

5 結(jié)語(yǔ)

結(jié)縷草作為草坪草種質(zhì)的主要缺點(diǎn)是生長(zhǎng)緩慢、生長(zhǎng)期短和抗寒性差，因此育種目標(biāo)多為提高其生長(zhǎng)和恢復(fù)速度及增強(qiáng)它對(duì)極端溫度的耐性，還有在低養(yǎng)護(hù)情況下延長(zhǎng)其生長(zhǎng)季節(jié)等方面[41]．華南地區(qū)地處水熱條件十分優(yōu)越的南亞熱帶，具有發(fā)展常綠型草坪的良好條件．該地區(qū)用作運(yùn)動(dòng)草坪的植物種類約有10種，但真正大面積種植的只有少數(shù)幾種，而在冬季能基本保持青綠的就更寥寥無(wú)幾；因此，將現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種手段相結(jié)合研究和培育抗逆性結(jié)縷草新品種，尤其是能在冬季保持青綠的高抗寒性新品種，是提高南方地區(qū)草坪質(zhì)量的重要前提．

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Recent Advance in Genetic Transformation of Zoysiagrass

LIU Yonghai,YU Le,CUI Tiecheng

(College of Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqing,Guangdong 526061,China)

Zoysiagrass(Zoysia spp.),mainly originated in East Asia,is a warm-season turfgrass with its many excellent properties.This paper covers the efficient establishing method of plant regeneration system for zoysiagrass,genetic transformation of exogenous resistance gene,and ecological environmental risk of transgenic zoysiagrass.The information will be useful for genetically improved cultivars with enhanced stress tolerance and extended greening periods through the biotechnology means.

zoysiagrass;genetic transformation;greening periods;cold resistance

S688

A

1009－8445（2012）05－0036－05

(責(zé)任編輯：陳 靜)

2011－11－24

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(S2011040001280);肇慶學(xué)院科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(201003,201102)

劉擁海(1972－),男,湖南邵東人,肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院副教授,博士．