郝 蘭 袁耿彪 王志剛

1.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，重慶 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，重慶 400010

腫瘤的靶向療法是利用特異性“靶向配基”的介導(dǎo)，將藥物或其他殺傷腫瘤的物質(zhì)選擇性地運(yùn)送到腫瘤部位、選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞以提高治療效果的一種治療方法。近年來國(guó)內(nèi)外核酸適體（aptamer）介導(dǎo)的主動(dòng)靶向給藥研究成為熱點(diǎn)。核酸適體（aptamer）是經(jīng)過一種新的體外篩選技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）， 從隨機(jī)單鏈寡聚核苷酸文庫中得到的能特異結(jié)合蛋白或其他小分子物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸，可以是RNA，也可以是DNA，長(zhǎng)度一般為25～60個(gè)核苷酸[1]。SELEX技術(shù)自Tuerk等[2]1990年發(fā)明以來，在臨床診斷、靶向藥物研制方面得以廣泛應(yīng)用。首個(gè)核酸適配體藥物“Macugen”[3]由美國(guó)FDA在2005年批準(zhǔn)上市，成為核酸適配體領(lǐng)域的一個(gè)里程碑。美國(guó)Achemix、SomaLogic，德國(guó)Noxxon AG等多個(gè)公司正在開發(fā)核酸適配體藥物和診斷試劑。腫瘤細(xì)胞靶向給藥是提高腫瘤治療效果減少毒副作用的有效途徑。將藥物偶聯(lián)于腫瘤細(xì)胞特異性配體上是靶向給藥的主要方法。核酸能特異性結(jié)合細(xì)胞并且隨之內(nèi)化，是理想的靶向細(xì)胞輸送劑。核酸適體“靶向配基”介導(dǎo)或修飾的藥物及藥物納米制劑，為主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞給藥系統(tǒng)構(gòu)建開拓了新方向。本文簡(jiǎn)要綜述適體作為腫瘤藥物“靶向配基”的應(yīng)用研究。

1 核酸適體作為腫瘤藥物“靶向配基”的優(yōu)勢(shì)

具有高特異性與親和性“靶向配基”的篩選，是制約主動(dòng)靶向給藥系統(tǒng)研究的瓶頸[4-5]。以往修飾腫瘤藥物的“靶向配基”是抗體、多肽和葉酸等分子，但這些配基修飾的靶向藥物在實(shí)際應(yīng)用中均存在著難以克服的缺陷。單克隆抗體潛在的免疫原性和制備的困難大大限制了其臨床的應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程[4]；葉酸等小分子雖然有諸多優(yōu)點(diǎn)，但要求病變組織細(xì)胞過多表達(dá)葉酸受體，靶向作用才得以實(shí)現(xiàn)[4-5]，而核酸適體卻具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.1 高親合力、強(qiáng)特異性

隨著體外高通量篩選技術(shù)SELEX的發(fā)展，篩選出的適體與配體間的親合力很高。單鏈寡核苷酸只識(shí)別與其互補(bǔ)的空間結(jié)構(gòu)，幾乎可以完全避免非特異性結(jié)合。

1.2 靶標(biāo)普適性

適體與靶標(biāo)的識(shí)別不是堿基配對(duì)，而是與靶標(biāo)在空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的匹配，是主動(dòng)靶向顯像及主動(dòng)靶向治療的優(yōu)選分子探針。

1.3 成本低廉、篩選制備技術(shù)成熟

目前細(xì)胞-SELEX技術(shù)成熟，適體篩選過程已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化[6]；篩選出的適體通過化學(xué)合成，純度高、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好。適體經(jīng)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾[7]，穩(wěn)定性提高，可在常溫下長(zhǎng)期保存及運(yùn)輸。

1.4 無免疫原性

適體在生物體系中不會(huì)引發(fā)免疫原性，在治療中無毒性[8]。在“靶向配基”修飾方面更優(yōu)于抗體等。

1.5 受體范圍廣泛

核酸適體結(jié)構(gòu)的多樣性導(dǎo)致其具有從小分子到蛋白質(zhì)，甚至到細(xì)胞的受體[9-10]。

核酸不但是生物體基因信息的儲(chǔ)存與傳遞的載體，而且也具有與蛋白類似的功能。越來越多的研究結(jié)果表明功能化核酸參與重要生命過程的調(diào)控。

2 核酸適體在藥物“靶向配基”中的應(yīng)用

2.1 核酸適體作為靶向藥物

首先核酸適體作為抑制劑能抑制腫瘤生長(zhǎng)過程中的相關(guān)靶蛋白。適體AS1411是首先進(jìn)入臨床研究的抑制癌癥適體藥物，它對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用主要是調(diào)節(jié)核酶活性，損傷DNA，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Laber等[11]進(jìn)行了AS1411 又稱為ARG001 臨床用藥劑量研究，實(shí)驗(yàn)表明從 1 mg/（kg·d）到 10 mg/（kg·d）晚期腫瘤患者都有治療效果而且沒有任何副作用。應(yīng)用SELEX篩選技術(shù)，Chen等[12]成功得到針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體-3（HER-3）的細(xì)胞外部分適體。研究指出其中的適體A30 可抑制MCF7 人乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.2 核酸適體為“靶向配基”的Aptmer-siRNA藥物

利用RNA干擾技術(shù)通過siRNA給藥能特異性抑制致病基因的表達(dá)，盡管作為藥物，siRNA在多種疾病治療領(lǐng)域有些許研究進(jìn)展[13]。但siRNA本身不具備對(duì)組織或細(xì)胞的靶向能力，靶向性仍然是影響該技術(shù)應(yīng)用到臨床治療上的主要障礙[14]。將核酸適體作為“靶向配基”介導(dǎo)siRNA輸送，能提高siRNA藥物的靶向性。Mcnamara等[15]將核酸適體A10 與siRNA連接建立適配體介導(dǎo)的靶向輸送siRNA藥物，干擾PSMA陽性表達(dá)的前列腺腫瘤細(xì)胞LNCaP生存所需基因的表達(dá)，并且體外觀察到，A10-siRNA結(jié)合體明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。Chu等[16]成功制備了適配子A9，適配子A9 較A10 具有更強(qiáng)的特異性識(shí)別前列腺癌變細(xì)胞表面抗原PSMA能力。將A9 適配體用生物素-親和素方法偶聯(lián)到siRNA鏈上，構(gòu)建靶向復(fù)合體A9-siRNA，能特異性抑制PSMA陽性表達(dá)的前列腺腫瘤細(xì)胞LNCaP生長(zhǎng)。研究同時(shí)指出A9-siRNA偶合體對(duì)基因表達(dá)抑制作用與A9-脂質(zhì)體偶合體類似。

2.3 核酸適體為“靶向配基”的納米粒

時(shí)下不同材料納米粒因其諸多特點(diǎn)：可控釋，易修飾，載藥性及可工業(yè)化生產(chǎn)等，在靶向藥物傳遞系統(tǒng)研究得到關(guān)注。Chen等[17]將巰基修飾的核酸適配子（aptmer）偶聯(lián)到金納米粒子（AuNPs）表面，制備出朊蛋白特異性的Apt-AuNPs納米光學(xué)探針，并成功應(yīng)用到細(xì)胞表面朊蛋白的光散射成像和電子透射顯微成像分析，通過對(duì)Apt-AuNPs探針進(jìn)入細(xì)胞的途徑研究表明，窖蛋白核酸適配子介導(dǎo)的內(nèi)吞作用可能是其進(jìn)入細(xì)胞的一個(gè)重要途徑。Lili等[18]所在課題組首次成功地用 （PAH/PSS）2 多層膜以及PAH-g-PEG-COOH修飾了BSA納米粒子，并在粒子表面偶聯(lián)適體AS1411，得到了同時(shí)具有靶向功能和pH響應(yīng)包埋釋放抗癌藥物的納米載體。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明這種粒子對(duì)肝癌細(xì)胞靶向性明顯，載藥后對(duì)肝癌細(xì)胞毒性增強(qiáng)。將核酸適配體共價(jià)結(jié)合到納米藥物載體上可顯著提升腫瘤靶細(xì)胞對(duì)納米載體的吞噬，增強(qiáng)所載抗癌藥在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

2.4 核酸適體為“靶向配基”的脂質(zhì)體

脂質(zhì)體作為藥物載體是通過細(xì)胞的高滲透和高保留效應(yīng)（enhanced permeability and retention，EPR effect）進(jìn)行被動(dòng)靶向。以核酸適體為靶向配基的脂質(zhì)體藥物主動(dòng)靶向運(yùn)輸系統(tǒng)既克服了脂質(zhì)體被動(dòng)靶向的低選擇性，同時(shí)提高了藥物的療效。Cao等[19]將核仁蛋白適體（nucleolin，NCL）偶聯(lián)到順鉑脂質(zhì)納米囊上。用連接NCL-適體的順鉑脂質(zhì)體制劑作用MCF-7 人乳腺癌細(xì)胞，存活率僅為40.5%，而未連接NCL-適體的順鉑脂質(zhì)制劑作用MCF-7 細(xì)胞，存活率高達(dá)88.9%。“靶向配基”NCL-適體大大地提高了藥物的化療效果。Kang等[20]篩選得到了sgc8 適體，將適體與包裹了熒光素-右旋糖酐（FITC-Dextran，F(xiàn)D）的脂質(zhì)體相連構(gòu)成適體靶向脂質(zhì)體，用其處理有sgc8 受體表達(dá)的CEM-CCRF細(xì)胞和無sgc8 受體表達(dá)的NB4 細(xì)胞共同培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)表明該適體靶向脂質(zhì)體對(duì)白血病CEM-CCRF細(xì)胞具有高度選擇性。

2.5 核酸適體為“靶向配基”的藥物

核酸適體修飾藥物是一種理想的靶向腫瘤藥物制備策略。適體A10 能特異性靶向結(jié)合前列腺癌變細(xì)胞表面抗原（PSMA）。Bagalkot等[21]將多柔比星扁平的芳香環(huán)與核酸適體A10 三維構(gòu)象中的短鏈結(jié)構(gòu)通過非共價(jià)作用連接，得到了適體-多柔比星靶向藥物。該適體-多柔比星靶向藥物對(duì)PSMA有陽性表達(dá)的前列腺癌LNCaP細(xì)胞具有高度的特異靶向作用。Chu等[22]將細(xì)胞毒蛋白gelonin與anti-PSMA適體連接，發(fā)現(xiàn)其對(duì)PSMA陽性的LNCaP表達(dá)細(xì)胞的毒性比PSMA陰性的PC-3 細(xì)胞大600 多倍。

3 展望

由于核酸適體獨(dú)有的特點(diǎn)，適體技術(shù)及其應(yīng)用成為時(shí)下研究的熱點(diǎn)，并在腫瘤的分子水平顯像及應(yīng)用于腫瘤靶向治療（核酸適體做“靶向配基”），取得令人鼓舞的成果。國(guó)內(nèi)譚蔚泓等[23]對(duì)適體的研究也贏得國(guó)內(nèi)外關(guān)注。將適體技術(shù)嫁接到微納米泡的靶向修飾中，有望實(shí)現(xiàn)分子水平的靶向顯像與靶向治療?？傊?，對(duì)核酸適體專家學(xué)者一致認(rèn)為：①核酸適體是潛在靶向藥物配基，同時(shí)能做干擾蛋白質(zhì)靶標(biāo)的靶向藥物，在創(chuàng)新藥物的研制方面具有很大的發(fā)展空間。②核酸適體與抗體相比免疫原性小；與基因治療相比，它可以細(xì)胞外或膜蛋白作為靶標(biāo)，避免必須輸運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的問題。③核酸適體在體內(nèi)的特異性有待驗(yàn)證，改變篩選條件提高適體特異性。

目前核酸適體的腫瘤醫(yī)學(xué)應(yīng)用國(guó)際上還在發(fā)展初期，挑戰(zhàn)與機(jī)遇并存，期盼適體技術(shù)在腫瘤的診斷與靶向治療方面發(fā)揮更大的作用。

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