李 欣，金秀東，初彥輝，趙冰海，李 麗，張際緋

(牡丹江醫(yī)學(xué)院1醫(yī)藥研究中心，2生理教研室，3組胚教研室，黑龍江牡丹江157011)

在西方發(fā)達(dá)國家，男性生殖障礙發(fā)病率逐年上升，已成為一個受重視的問題。男性兒童生殖系統(tǒng)的畸變包括尿道下裂和隱睪，青春期發(fā)育的紊亂和成年生殖系統(tǒng)的腫瘤以及精子發(fā)生障礙統(tǒng)稱為睪丸紊亂綜合征。已有一些動物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)研究表明這些疾病與胎兒期母體及胎兒暴露于環(huán)境內(nèi)分泌干擾因素有關(guān)。全氟有機(jī)化合物作為一種人造材料具有持久性、高度生物累積性、毒性及可以遠(yuǎn)距離環(huán)境遷移的特點(diǎn)，符合斯德哥爾摩公約關(guān)于持久性有機(jī)污染物定義特征，因而引起了更加廣泛的關(guān)注，全球限用全氟辛烷磺酸鹽(perfluorooctane sulfonate，PFOS)及其衍生物的呼聲越來越高。胚胎期Leydig細(xì)胞只出現(xiàn)在胚胎期睪丸中，因此認(rèn)為其分化受染色體組分或睪丸特殊機(jī)制調(diào)控。本研究利用出生前PFOS暴露的染毒方式，監(jiān)子代一般毒性和睪丸內(nèi) Cyp17α1 mRNA表達(dá)水平以探討PFOS致生殖毒性的可能機(jī)制，為PFOS安全性評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 動物為清潔級成年SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。大鼠飼養(yǎng)于其底裝鋪墊料的多聚碳酸塑料籠具，每籠飼喂1只，連接于獨(dú)立供氣動物籠系統(tǒng)，溫度控制在20～25℃，相對濕度40%～60%。照明為普通日光燈，12 h明亮，12 h黑暗。上述動物按隨機(jī)數(shù)字法分為4組:0.05%TW-20(對照組)、5 mg/(kg·d)(低劑量灌胃組)、、10 mg/(kg·d)(中劑量灌胃組)、20 mg/(kg·d)(高劑量灌胃組)，各4只。

1.2 方法

1.2.1 材料與試劑 試劑PFOS購于sigma公司，RNA提取試劑盒(OMEGA，USA，SYBR(TAKARA，大連)引物設(shè)計(jì)參照GenBank中序列由上海Invitrogen公司合成，18Srna為內(nèi)參序列。

1.2.2 動物染毒 SD孕鼠，從孕第11天至孕第19天，每天對給藥動物組腹腔注射染毒PFOS。胎鼠睪丸于母鼠懷孕第20天處死孕鼠，取出胎鼠，記錄胎鼠個數(shù)，并稱量胎鼠個體的質(zhì)量。立體顯微鏡下解剖胎鼠，辨明其雌、雄，觀察睪丸位置和睪丸引帶發(fā)育情況。同一胎鼠的2只睪丸分別用于提取 RNA和蛋白質(zhì)，均保存于液氮備用。

1.2.3 real-time聚合酶鏈反應(yīng)檢測mRNA 取一側(cè)胎鼠睪丸提取RNA，操作按RNA提取試劑盒說明要求進(jìn)行，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定 D260/D280比值均＞1.8，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。樣本設(shè)兩個復(fù)孔，取其CT均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出目的基因相對表達(dá)量。聚合酶鏈反應(yīng)引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 real-time PCR所用引物

2 結(jié)果

2.1 四組孕鼠平均胎鼠個數(shù)、雌雄比例、雄胎鼠體重和睪丸質(zhì)量的比較 四組孕鼠平均胎鼠數(shù)、雄性胎鼠體質(zhì)量、睪丸重量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與對照組比較，低劑量組孕鼠平均胎鼠數(shù)增多(P＜0.05)，低劑量組和高劑量組雄性胎鼠體質(zhì)量均明顯降低，中劑量組升高(P＜0.01)，高劑量組睪丸重量下降(P＜0.05)(表2)。

表2 四組孕鼠平均胎鼠個數(shù)、雌雄比例、雄胎鼠體重和睪丸質(zhì)量比較

2.2 睪丸內(nèi)Cyp17α1 mRNA表達(dá)水平的變化 各給藥組與對照組比較，睪丸組織中Cyp17α1的表達(dá)量明顯下降(P＜0.01)(圖1)。

圖1 睪丸內(nèi)Cyp17α1 mRNA表達(dá)水平的變化

3 討論

長期以來，人們通常把化學(xué)物質(zhì)對胚胎或胎兒的潛在毒性效應(yīng)視為研究生殖毒理學(xué)的重點(diǎn)。近年來很多研究表明，化學(xué)物質(zhì)對生殖的損害都表現(xiàn)在對性腺的損害。因此，以性腺為研究對象可以更直接的表現(xiàn)化學(xué)物質(zhì)對生殖系統(tǒng)的毒性，發(fā)掘睪丸紊亂綜合征的原因。Leydig細(xì)胞是一類位于哺乳動物睪丸曲細(xì)精管間的間質(zhì)細(xì)胞，它在睪丸發(fā)育、精子發(fā)生、雄性表型及生精管道的發(fā)育中行使重要的功能。Leydig細(xì)胞可分為胎兒型及成年型。胎兒型Leydig的主要功能是產(chǎn)生雄激素，維持機(jī)體男性化［1］。

研究發(fā)現(xiàn)嚙齒類動物胚胎發(fā)生期的胚胎Leydig細(xì)胞在妊娠第12天出現(xiàn)，出生前1～2 d其合成能力達(dá)到最強(qiáng)，出生后很快消失［2］。本研究選擇暴露期從母鼠受孕第12天起，至第19天結(jié)束灌胃的方式染毒。結(jié)果顯示，與對照組比較，低劑量組孕期暴露于PFOS的孕鼠平均妊娠胎鼠數(shù)數(shù)量增多(P＜0.05)，其原因是懷孕中期給藥，孕鼠暴露于PFOS時胚胎數(shù)和性別基因已經(jīng)確定，因此無法說明PFOS對胚胎發(fā)育的個數(shù)和性別確實(shí)有影響，此參數(shù)只作為參考。與對照組比較，低劑量組和高劑量組雄性胎鼠體質(zhì)量均明顯降低(P＜0.05)，而中劑量組則升高(P＜0.01)，說明PFOS對胚胎發(fā)育有影響。

睪酮是外源性化學(xué)物質(zhì)影響雄性生殖系統(tǒng)的靶標(biāo)之一。它主要由Leydig分泌，能刺激雄性生殖器官的成熟和發(fā)育、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、促進(jìn)精子發(fā)生，并且通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制使雄激素的分泌相對穩(wěn)定，從而維持機(jī)體的正常生理功能。它的生成需要一些酶的參與，如細(xì)胞色素 P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶、β-羥-類固醇脫氫酶、17α羥化酶(P450c17)、17β羥類固醇脫氫酶，其中只有 P450c17相對的基因Cyp17α1與對照組相比表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Cyp17α1基因全長大約6 kb，含有8個外顯子，在人體的染色體中定位于10q24.3，編碼508個氨基酸，是單拷貝基因［3］。P450c17在嚙齒類動物的性腺和胎盤中表達(dá)而不是在腎上腺，雄性則主要在睪丸中表達(dá)［4］。

有實(shí)驗(yàn)表明，雌性大鼠孕期攝入環(huán)境雌激素可減少雄性胎鼠睪丸間質(zhì)中合成睪酮所必需的P45017α-羥化酶/C17，20裂解酶的表達(dá)，從而減少睪酮的合成量，影響胎鼠的雄性化過程［5］。P450c17是睪酮生成的關(guān)鍵酶，而且在早期胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。有人在正常小鼠胚胎內(nèi)胚層發(fā)現(xiàn)了P450c17酶的活性，刪除鼠標(biāo)P450c17基因可導(dǎo)致早期胚胎死亡［6］。在本實(shí)驗(yàn)中，與對照組比較，各給藥組Cyp17α1基因表達(dá)均降低，表明PFOS對Cyp17α1有抑制作用。P450c17是 Cyp17α1基因的產(chǎn)物，P450c17是把孕酮轉(zhuǎn)變成雄烯二酮的關(guān)鍵酶，Cyp17α1表達(dá)減少可導(dǎo)致睪酮生成減少。綜上所述，PFOS具有發(fā)育和生殖毒性，孕期接觸PFOS可引起胚胎發(fā)育和雄性生殖系統(tǒng)的異常。

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［4］ Shi Y，Schonemann MD，Mellon SH.Regulation of P450c17 expression in the early embryo depends on GATA factors［J］.Endocrinology，2009，150(2):946-956.

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