廉 超， 王曉通， 謝玉波， 肖 強(qiáng)△

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1胃腸腺體外科，2麻醉科，廣西南寧530021)

在我國(guó)，胃癌的發(fā)病率及死亡率位居所有惡性腫瘤首位。而胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多基因參與的復(fù)雜過(guò)程。E2F1轉(zhuǎn)錄因子(E2F1 transcription factor)作為重要的細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤發(fā)生發(fā)展及細(xì)胞凋亡調(diào)控密切相關(guān)［1］。我們前期研究顯示，E2F1在人胃癌組織中呈高表達(dá)，在癌旁和正常組織中均呈低表達(dá)［2］，這提示E2F1的表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)，以E2F1為誘餌蛋白，從人正常胃黏膜細(xì)胞的cDNA文庫(kù)中篩選出E2F1相互作用蛋白，為進(jìn)一步研究E2F1影響胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

酵母表達(dá)載體pGBKT7、酵母表達(dá)載體pGADT7、人正常胃黏膜細(xì)胞 cDNA 文庫(kù)［3］和 pGBKT7－E2F1誘餌質(zhì)粒［4］均由本實(shí)驗(yàn)室保存;酵母菌AH109、SD酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基和－Trp－Leu－Ade－His營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、－Trp－Leu營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、YPAD培養(yǎng)基和X－Gal均購(gòu)自Clontech;測(cè)序公司為北京蛋白質(zhì)組研究中心(BPRC)。

2 方法

2.1 酵母感受態(tài)制備及文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率測(cè)定 按照Clontech公司說(shuō)明書(shū)(Matchmaker system Yeast Protocols Handbook)方法制備AH109感受態(tài)細(xì)胞，將pGBKT7－E2F1 pGADT7和文庫(kù)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，最終得到酵母菌種懸濁液10 mL，取10 μL 稀釋 107倍，再取 100 μL 涂布于 SD/－Trp－Leu的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板，30℃培養(yǎng)3～5 d，經(jīng)觀察，共生長(zhǎng)出18個(gè)單克隆，并據(jù)此計(jì)算文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率。

2.2 酵母雙雜交篩選陽(yáng)性克隆 將共轉(zhuǎn)化后的AH109首先劃線于SD/－Trp/－Leu/－Ade/－His培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)3～5 d，待長(zhǎng)出克隆后，挑取，依次劃線于SD/－Trp/－Leu培養(yǎng)基平板，使其充分地生長(zhǎng)復(fù)蘇。并同時(shí)劃線陽(yáng)性對(duì)照(以pGBKT7－53和pGADT7－T質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的AH109)和陰性對(duì)照(以 pGBKT7－Lam和pGADT7－T質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的AH109)，待其達(dá)到良好生長(zhǎng)狀態(tài)后(24 h左右)，再用滅菌絨布原位復(fù)制劃線至SD/－Trp/－Leu/－Ade/－His培養(yǎng)基平板，用以檢測(cè)His和Ade雙報(bào)告基因表型。與此同時(shí)亦復(fù)制劃線于鋪有濾紙的平板，30℃培養(yǎng)24 h左右，進(jìn)行X－Gal濾膜分析，以檢測(cè)LacZ報(bào)告基因，篩選出陽(yáng)性克隆20個(gè)。

2.3 回轉(zhuǎn)驗(yàn)證及測(cè)序分析 將篩庫(kù)所得陽(yáng)性克隆全部劃線于SD/－Trp/－Leu和 SD/－Trp/－Leu/－Ade/－His兩平板，與初篩時(shí)方法相同，兩板分別劃線陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。劃線重復(fù)4次，觀察陽(yáng)性克隆在平板上生長(zhǎng)情況，之后進(jìn)行X－Gal濾膜分析。通過(guò)反復(fù)劃線，一方面再次檢驗(yàn)誘餌蛋白和文庫(kù)蛋白的相互作用，另一方面可使質(zhì)粒分散排布，并能通過(guò)反復(fù)劃線對(duì)假陽(yáng)性進(jìn)行初步排除。將回轉(zhuǎn)陽(yáng)性的質(zhì)粒送北京蛋白質(zhì)組研究中心測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST同源序列比對(duì)。

結(jié) 果

1 文庫(kù)篩選結(jié)果

按照Clontech公司說(shuō)明書(shū)(Matchmaker system Yeast Protocols Handbook)要求，篩庫(kù)總轉(zhuǎn)化效率達(dá)到1.0×106cfu/μg表示文庫(kù)篩選試驗(yàn)操作成功。經(jīng)計(jì)算，文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率為:18/100 ×107=1.8 ×106cfu/μg ＞1.0 ×106cfu/μg，故滿足文庫(kù)篩選要求，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The growth of yeast clones in SD/－Leu－Trp Petri dish.圖1 稀釋107倍后涂布于SD/－Leu－Trp平板上的單克隆生長(zhǎng)情況

2 陽(yáng)性克隆的鑒定

在SD/－Trp/－Leu/－Ade/－His培養(yǎng)基平板上共篩選得到陽(yáng)性克隆21個(gè)。將這21個(gè)初篩的陽(yáng)性克隆重新劃線于SD/－Trp/－Leu培養(yǎng)基平板，使其充分地生長(zhǎng)復(fù)蘇，之后用滅菌絨布原位復(fù)制劃線于SD/－Trp/－Leu/－Ade/－His平板上，經(jīng)X－Gal濾膜分析證實(shí)其中有21個(gè)陽(yáng)性克隆表型為Ade+、His+、Leu+、Trp+和 LacZ+，見(jiàn)圖 2。

Figure 2.The growth of converted AH109 in SD/－Leu－Trp and SD/－Leu－Trp－His－Ade Petri dishes and the result of X－Gal staining(primary screening).A:positive control group(pGBKT7－53+pGADT－T);B:negative control group(pGBKT7－lam+pGADT－T).圖2 共轉(zhuǎn)化AH109在三平板上的生長(zhǎng)情況

3 回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

將獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒一對(duì)一與誘餌質(zhì)粒pGBKT7－E2F－1重新共轉(zhuǎn)化AH109酵母菌后，重復(fù)劃線4次，經(jīng)X－Gal濾膜分析，篩除1組假陽(yáng)性克隆，最終得到表達(dá)His、Ade和LacZ的候選陽(yáng)性克隆20個(gè)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The growth of converted AH109 in SD/－Leu－Trp and SD/－Leu－Trp－His－Ade Petri dishes and the result of X－Gal staining(secondary screening).A:positive control group(pGBKT7－53+pGADT－T);B:negative control group(pGBKT7－lam+pGADT－T).圖3 共轉(zhuǎn)化AH109在三平板上的生長(zhǎng)情況

4 候選陽(yáng)性克隆的測(cè)序及比對(duì)結(jié)果

經(jīng)測(cè)序和同源序列比對(duì)，最終得到18個(gè)不同的候選基因序列，它們分別是:組織蛋白酶B(cathepsin B，CB)、SIVA1、干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)、鳥(niǎo)苷酸激酶1(guanylate kinase 1，GUK1)、ATP酶抑制因子1(ATPase inhibitory factor 1，ATPIF1)、核糖體蛋白 SA(ribosomal protein SA，RPSA)、纖溶酶原激活物抑制劑1 mRNA結(jié)合蛋白(serpine 1 mRNA binding protein 1，SERBP1)、精氨琥珀酸合酶1(argininosuccinate synthase 1，ASS1)、卵泡抑素類似物3(follistatin－like 3，F(xiàn)STL3)、金屬硫蛋白 2A(metallothionein 2A，MT2A)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白 1(reticulocalbin 1，RCN1)、WNT1可誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白2(WNT1 inducible signaling pathway protein 2，WISP2)、CDC42 效應(yīng)蛋白 1(CDC42 effector protein 1，CDC42EP1)、可溶性半乳糖凝集素結(jié)合蛋白1(lectin galactoside－binding soluble 1，LGALS1)、中胚層發(fā)育候選2(mesoderm development candidate 2，MESDC2)、外切酶體成分7(exosome component 7，EXOSC7)和含EGF腓骨蛋白樣胞外基質(zhì)蛋白1(EGF－containing fibulin－like extracellular matrix protein 1，EFEMP1)，還有一未知基因片段，見(jiàn)表1。

表1 E2F1相互作用蛋白的基因測(cè)序結(jié)果Table 1.Genetic sequence report of proteins interacting with E2F1

討 論

轉(zhuǎn)錄因子E2F家族在控制細(xì)胞周期的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。E2F1作為E2F家族重要成員之一，是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制Rb/E2F通路中重要的轉(zhuǎn)錄活化因子。它通過(guò)與Rb及相關(guān)蛋白等多種依賴細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)及酶類相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期由G1期向S期過(guò)渡，是細(xì)胞增殖和發(fā)育所必需的因子之一。我們前期研究顯示:E2F1的高表達(dá)或沉默在體內(nèi)及體外環(huán)境下均可明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)，使細(xì)胞周期阻滯在G1/S期，胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯減弱，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［5－8］，但其具體機(jī)制尚未明確。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)最終成功篩選出18種E2F1相互作用蛋白，其中CB和SIVA1已被廣泛認(rèn)可并已證實(shí)與E2F1及腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CB是細(xì)胞溶酶體內(nèi)的一種半胱氨酸蛋白酶，能夠直接降解或激活纖溶酶原激活劑及基質(zhì)金屬蛋白酶等而間接降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，CB對(duì)基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解被認(rèn)為是腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一［9］。近年來(lái)大量研究證實(shí)，CB在胃癌、腸癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、黑色素瘤和甲狀腺癌等多種惡性腫瘤組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)且CB活性遠(yuǎn)高于鄰近正常組織［10－12］，這說(shuō)明CB與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。此外，Gopinath等［13］研究發(fā)現(xiàn)，CB可明顯抑制p－ERK和c－Myc的表達(dá)，促使E2F1過(guò)表達(dá)，阻礙口袋蛋白的磷酸化進(jìn)程，進(jìn)而使p27表達(dá)上調(diào)，最終抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。SIVA是一種促凋亡蛋白，該蛋白與腫瘤壞死因子受體家族和抗凋亡Bcl－2家族密切相關(guān)。SIVA存在2種剪切變體，即SIVA1和SIVA2，其中SIVA1被認(rèn)為對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)起到至關(guān)重要的作用。最新研究表明，促凋亡基因SIVA是抑癌基因p53和E2F1的直接轉(zhuǎn)錄靶向基因，SIVA過(guò)表達(dá)不僅可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，還可抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［14－15］。Ray 等［16］也發(fā)現(xiàn)，pRb 高表達(dá)可使 E2F1 表達(dá)明顯增加，而E2F1表達(dá)上調(diào)會(huì)激活SIVA1轉(zhuǎn)錄途徑，促使SIVA1過(guò)表達(dá)，進(jìn)而相繼激活caspase－9和caspase－3，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以上研究成果均表明，CB和SIVA1不僅在分子機(jī)制上與E2F1聯(lián)系緊密，更與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，E2F1極有可能通過(guò)與CB和SIVA1相互作用，經(jīng)過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為。另外，在本實(shí)驗(yàn)中，除 CB 和 SIVA1外，MT2A、RPSA、GUK1、ATPIF1、SERBP1、ASS1、MESDC2、WISP2、RCN1、CDC42EP1、EXOSC7、EFEMP1、FSTL3、IRF7、LGALS1等基因均為本次酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出的差異表達(dá)基因，提示這些基因與E2F1也可能有著密切的聯(lián)系。

酵母細(xì)胞是最簡(jiǎn)單的真核細(xì)胞，其體內(nèi)蛋白質(zhì)合成后加工、修飾類型及其程度與哺乳動(dòng)物的相應(yīng)過(guò)程存在一定差異，因此酵母雙雜交的結(jié)果僅僅是初步提出相互作用的可能性，要進(jìn)一步確認(rèn)CB、SIVA1等蛋白與E2F1的關(guān)系，還需在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中加以驗(yàn)證。對(duì)此，我們將會(huì)在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，選取篩選得到的相互作用蛋白構(gòu)建真核表達(dá)載體，分別與E2F1共轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞，以免疫共沉淀和激光共聚焦等方法進(jìn)一步驗(yàn)證其相互作用，進(jìn)而明確E2F1影響胃癌發(fā)生發(fā)展的基因通路，從而為E2F1潛在的基因治療研究奠定基礎(chǔ)。

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